[发明专利]一种提取农杆菌质粒DNA的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种提取农杆菌质粒DNA的试剂盒，属于生物技术领域。

技术背景

农杆菌质粒DNA的提取和检测在植物基因工程研究中是必需的试验，也是在分子生物学试验中一项常规技术。农杆菌转化系统是一种天然的基因转化系统。农杆菌分为根瘤农杆菌和发根农杆菌。根瘤农杆菌中含有肿瘤诱导(T)质粒,Ti质粒上含有可转移DNA(T-DNA)区、毒性区(Vir区)以及冠瘿碱代谢基因编码区。T-DNA两端是两个25bp的重复序列，分别称为左边界和右边界，两个边界序列之间是生长素和细胞分裂素合成基因以及冠瘿碱合成基因。Vir区中也含有多个基因段，如FiM、FirB、FirC、VirD.、VirE、VirG、VirH等，每个基因段都含有多个基因。当植物受到伤害时，分泌含有酚类化合物的汁液，这些酚类化合物一方面通过染色体毒性基因(chvA、chvB等介导的趋化性促使农杆菌向植物受伤部位移动并附着于植物细胞表面；另一方面则被Ti质粒上由VirA和VirG组成的双组分调节系统识别，从而诱导其他Vir的表达。VirD1和VirD2共同作用，由T-DNA右边界开始向左边界切割产生—条T-DNA单链，并与Vir其它表达蛋白结合成复合体转移到农杆菌外，然后进入细胞到达细胞核内并整合到细胞染色体上。

转基因植物在近代工业、医药业、特别是农业等各个领域的研究和应用越来越为人类所重视。通过农杆菌对植物植株、器官、组织及细胞的侵染进行质粒转化，是将外源基因导入目的植物的重要方法之一。将外源基因人为导入天然植物中，从遗传物质水平上对植物进行有目的改造，由此获得转基因植物，其性状将按着有利于人们需要的方向发生改变。如转基因的抗虫棉花，通过人们的改造，使棉花在生长过程中体内能够自主地产生抵抗害虫的毒素，以达到自我保护、减少农药使用增产增收的目的。

为了更好地将外源基因导入目的植物，需要研制一种提取农杆菌质粒DNA的方法。因此研制一种农杆菌质粒DNA提取的试剂盒对于外源基因整合到植物基因组中，参与植物基因调控表达具有重要意义。

发明内容：

本发明提供一种提取农杆菌质粒DNA的试剂盒，利用该试剂盒可以方便、快速地提取到农杆菌的质粒DNA。

一种提取农杆菌质粒DNA的试剂盒，包括农杆菌菌液培养，农杆菌细胞破碎，DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除，DNA洗脱，具体步骤如下：

农杆菌菌液培养：挑取含有质粒的农杆菌菌株接种到50-100mlYEB液体培养基中，在恒温摇床上28-30℃,160-200rpm/h,培养40-48h。吸取2-4ml菌液于5ml离心管中，10000-13000rpm/min离心5-10min，弃上清，保留沉淀。

农杆菌细胞破碎：往含有农杆菌沉淀的5ml离心管中加入3-4mlBufferA,漩涡悬浮菌体后10000-13000rpm/h离心3-5min，弃上清，保留沉淀。往沉淀中加入3-4mlBufferA,漩涡悬浮菌体后10000-13000rpm/h离心3-5min，弃上清，保留沉淀。往沉淀中加入0.4-0.5mlBufferB，漩涡悬浮菌体，室温下静止10-20min，加入0.8-1ml新配置的BufferC，上下颠倒离心管5-10次，室温下静止10-20min，加入0.4-1mlBufferD，轻柔颠倒离心管数次，使其充分混匀。加入0.2-1mlBufferE，轻柔颠倒离心管数次，使其充分混匀，将离心管冰浴5-10min后10000-13000rpm/h离心10-15min，将上清转入新的离心管中。加入与上清等体积的BufferF溶液抽提，10000-13000rpm/min离心5-10分钟，将上清转移至新的离心管中。加入与上清等体积的BufferG抽提，10000-13000rpm/min离心10-20分钟，将上清转移至新的离心管中。

DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除：往离心管中加入两倍体积的沉淀剂，混匀后加入DNA吸附柱，10000-13000rpm/min离心1-2min，弃废液，加入500-600μl去蛋白液，10000-13000rpm/min离心1-2min，弃废液，加入300-500μl漂洗液，12000-13000rpm/min离心1-2min，弃废液，加入500-600μl漂洗液，12000-13000rpm/min离心1-2min，弃废液，12000-13000rpm/min离心1-2min，静置吹干。