[发明专利]磁珠法提取革兰氏阴性菌基因组的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种磁珠法提取革兰氏阴性菌基因组的方法，属于生物技术领域。

技术背景

革兰阳性菌、革兰阴性菌是根据对细菌进行革兰氏染色的结果来区分的，如果将细菌作革兰氏染色，凡染后菌体呈紫色的，称“革兰氏阳性菌”，菌体呈伊红色，称“革兰氏阴性菌”。无论阳性菌还是阴性菌都有杆菌和球菌。葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌是临床最为常见的病原菌，葡萄球菌属于革兰阳性球菌，大肠杆菌属于革兰阴性菌中的肠杆菌科，除大肠杆菌以外，临床较常见的肠杆菌科细菌还有变形杆菌、沙门氏菌、克雷白杆菌；绿脓杆菌属于假单胞菌，为非发酵菌，是临床常见的较耐药革兰阴性杆菌。

革兰氏阴性菌是原核生物，构造相对简单，遗传背景清晰，培养操作容易，因此也常常被作为基因工程的对象加以利用：研究者常常将外源基因导入质粒，将质粒整合入革兰氏阴性菌基因，这样，革兰氏阴性菌就能够表达基因重组后的蛋白(例如胰岛素，某些疫苗等)了。此外，革兰氏阴性菌还常常作为模型生物参与细胞学实验。

革兰氏阴性菌分布广泛，是微生物遗传学和分子遗传学重要的研究对象，对革兰氏阴性菌遗传学研究的许多重要发现，加深了我们在分子水平上对生物遗传机制的理解；同时由于我们对革兰氏阴性菌遗传背景有较深的了解，革兰氏阴性菌在基因工程研究中占据着不可替代的重要地位。为了更好地研究革兰氏阴性菌的遗传信息，需要提取革兰氏阴性菌的基因组DNA。研制一种适用于革兰氏阴性菌基因组DNA提取的方便、快捷、实用的方法，解决使用常规方法所获得的DNA样品提取时间长的问题。此外，有效的提取革兰氏阴性菌基因组DNA，能够为进行基因分析与基因克隆提供重要保证，从而丰富基因组学的研究内容。

发明内容：

本发明提供一种磁珠法提取革兰氏阴性菌基因组的方法，与传统方法相比，利用该方法能够方便、快捷地提取革兰氏阴性菌基因组。

磁珠法提取革兰氏阴性菌基因组的方法，包括革兰氏阴性菌细胞的破碎，DNA的游离与杂蛋白的抽除，磁珠法快速纯化基因组DNA，具体步骤如下：

革兰氏阴性菌细胞的破碎：取1.5ml革兰氏阴性菌过夜培养液加到1.5ml离心管中，10000-13000rpm/min离心1-5分钟后弃上清。往菌体沉淀中加入0.5-1ml溶菌酶溶液悬浮沉淀，37℃温育2-4h。加入0.5-1ml SDS溶液，反复颠倒混匀10-20min，10000-13000rpm/min离心10-20分钟后取上清至新的1.5ml离心管。

DNA的游离与杂蛋白的抽除：加入200-600μl酚、氯仿和异戊醇抽提，其中酚：氯仿：异戊醇的体积比为25:24:1，10000-13000rpm/min离心10-20分钟，将上清转移至干净的1.5ml离心管中。加入200-600μl氯仿和异戊醇抽提，其中氯仿：异戊醇体积比为24:1，10000-13000rpm/min离心10-20分钟，将上清转移至干净的1.5ml离心管中。

磁珠法快速纯化基因组DNA：往溶液中加入等体积的Buffer A。震荡10-30s。室温放置1-10min，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离。经观察，待磁珠吸附到离心管一侧时，吸去液体，保留磁珠。往含有磁珠的离心管中加入0.5-1.5ml Buffer B,打匀后室温静止5-10min，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离。经观察，待磁珠吸附到离心管一侧时吸去液体，保留磁珠。往含有磁珠的离心管中加入30-60μl Buffer C，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离。经观察，待磁珠吸附到离心管一侧时吸取液体，此溶液即为革兰氏阴性菌基因组DNA产物。于1％琼脂糖凝胶中电泳检测。

所述的溶菌酶溶液：0.1-0.3mol/L氯化钠(Nacl)，0.1-0.2mol/L乙二胺四乙酸(EDTA),10-20mg/ml溶菌酶，PH＝7-9。

所述的SDS溶液：0.1-0.2mol/L氯化钠(Nacl)，0.1-1mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)，5-20％质量体积比的十二烷基硫酸钠(SDS),PH＝7-9。

所述的Buffer A:异丙醇：磁珠混悬液的体积比为24:1，其中磁珠混悬液由磁珠和水按照1:2体积比配置。

所述的Buffer B:4.3-21.4mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris),2.1-4.2mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),42.9-85.7mmol/L氯化钠(Nacl)，60-80％无水乙醇。

所述的Buffer C:5-10mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)，PH＝7.0-9.0。