[发明专利]一种快速检测弓形虫并鉴定毒力强弱的诊断方法

权利要求书

1.一种快速检测食用肉及其制品内弓形虫并同时能快速鉴定该虫株毒力强弱的诊断方法，其特征在于根据弓形虫rop18 ups作为特征靶基因设计出1对特异性引物F1、F2：

F1: 5’- GACTCCTCTGTCGGTCCTT -3’，如SEQ ID NO.1所示；

F2: 5’- GCCGATTGGACTGACTG -3’ ，如SEQ ID NO.2所示；

该方法包括以下步骤：

步骤(1).样品前处理：

将待检测的食用肉及其制品与灭菌后的蒸馏水混合，采用组织匀浆机均质，得到组织匀浆样品；

步骤(2).样品DNA提取：

取50 mg步骤（1）处理后的组织匀浆样品，加入200 µl pH值为8.0 的TE缓冲溶液，涡旋混匀；加入400 µl裂解液，混匀后加600 µl酚-氯仿-异戊醇混合溶剂，剧烈振荡，12000 g离心10 min；取上清液，加入与该上清液等体积的氯仿-异戊醇混合溶剂，剧烈振荡，12000 g 离心10min；取上清液，加入与该上清液等体积的氯仿，剧烈振荡，12000 g离心10 min；取上清液，加入为该上清液0.8倍体积的异丙醇，12000 g离心l0 min；取沉淀，用体积含量为70﹪的乙醇清洗1次，再在常温或50℃下晾干20 min，然后加入80 µl pH值为8.0 的TE缓冲溶液溶解，得到DNA提取物；将DNA提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板DNA的浓度与纯度；

步骤(3). PCR扩增：

将PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

所述的PCR 扩增反应体系为25 µl由10×PCR Buffer 2.5 µl，浓度为2.5 U/µl 的Taq DNA 聚合酶0.25 µl，浓度为2.5 mmol/L 的dNTPs 2.0 µl，加入引物2 µl，模板DNA 2.0 µl和余量的灭菌蒸馏水组成；其中加入引物为特异性引物F1、F2；

步骤(4).扩增产物电泳检测：

PCR扩增反应结束后，取3 µl 扩增产物与1 µl 6×Loading Buffer混合，1﹪琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统中观察并记录；根据出现的不同扩增片段大小判断弓形虫毒力情况。

2.如权利要求1所述的一种快速检测食用肉及其制品内弓形虫并同时能快速鉴定该虫株毒力强弱的诊断方法，其特征在于步骤(2)所述的酚-氯仿-异戊醇混合溶剂由酚、氯仿、异戊醇按照体积比25：24：1混合而成。

3.如权利要求1所述的一种快速检测食用肉及其制品内弓形虫并同时能快速鉴定该虫株毒力强弱的诊断方法，其特征在于步骤(2)所述的氯仿-异戊醇混合溶剂由氯仿、异戊醇按照体积比24：1混合而成。

4.如权利要求1所述的一种快速检测食用肉及其制品内弓形虫并同时能快速鉴定该虫株毒力强弱的诊断方法，其特征在于步骤(2)所述的TE缓冲液为1 ml 浓度为1 M 、pH值为 8.0的Tris-Cl，0.2 ml浓度为 0.5 M、pH值为 8.0的EDTA，定容至100 ml溶液。

5.如权利要求1所述的一种快速检测食用肉及其制品内弓形虫并同时能快速鉴定该虫株毒力强弱的诊断方法，其特征在于步骤(2)所述的裂解液为Tris-HCl、乙二胺四乙酸EDTA、NaCl、蛋白酶K、十二烷基硫酸钠SDS组成的混合液，其中Tris-HCl的浓度为50 mM、 pH值为 8.0，乙二胺四乙酸EDTA的浓度为25 mM，NaCl的浓度为100 mM，蛋白酶K的浓度为20 µg/µL，十二烷基硫酸钠SDS的质量分数为10﹪。

6.如权利要求1所述的一种快速检测食用肉及其制品内弓形虫并同时能快速鉴定该虫株毒力强弱的诊断方法，其特征在于步骤(3)所述的加入引物为特异性引物F1、F2,引物的浓度均为25µM。

7.如权利要求1所述的一种快速检测食用肉及其制品内弓形虫并同时能快速鉴定该虫株毒力强弱的诊断方法，其特征在于步骤(3)所述的PCR反应程序：94 ℃预变性4 min；94℃ 变性30 S，58 ℃ 退火30 S，72℃ 延伸30 S，30个循环；72 ℃延伸7 min。

8.如权利要求1所述的一种快速检测食用肉及其制品内弓形虫并同时能快速鉴定该虫株毒力强弱的诊断方法，其特征在于步骤(4)凝胶电泳后，在350 bp左右出现条带表明，该样品存在弓形虫，而且该虫株属于强毒力虫株；如果在650 bp左右出现条带，表明该样品存在弓形虫，而且该虫株属于弱毒力虫株；如果无条带出现，则表明该样品无弓形虫污染。