[发明专利]自组装间充质干细胞团块的制备、诱导分化及应用

说明书

技术领域

本发明属于干细胞技术领域，具体涉及一种自组装间充质干细胞团块的制备方法，向软骨细胞分化的方法，及其在关节软骨缺损修复中的应用。

背景技术

自体软骨细胞移植（Autologous Chondrocytes Implantation，ACI）是目前治疗较大面积软骨缺损最先进的方法，是将患者自体软骨细胞在体外进行扩增，再与支架材料复合后进行三维培养，最后将“细胞—材料”复合物移植到软骨缺损部位。然而，软骨细胞是一种数量很少的终末分化细胞，传代培养困难且容易失去软骨表型。软骨细胞数量少、难增殖、去分化的缺点限制了自体软骨细胞移植技术在临床的应用。

间充质干细胞是一种来源于发育早期中胚层和外胚层的多潜能干细胞，存在于脂肪、骨髓、滑膜、脐带血等多种组织中。间充质干细胞具有在体外培养条件下快速增殖的能力，并且能在特定的条件下向软骨细胞分化。因此，间充质干细胞是关节软骨缺损修复中极具前景的细胞来源。

研究发现，适当的生长因子组合和高密度三维动态培养是间充质干细胞向软骨细胞分化的关键因素。专利公布号为103223194A的中国专利公开了一种用于软骨损伤修复的软骨移植物及其制备方法，将脂肪间充质干细胞和软骨细胞植入Ⅰ型胶原的三维基材中进行共培养，使脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化以弥补软骨细胞的不足。专利公布号为103966161A的中国专利公开了一种模拟体内微环境的干细胞培养体系，用琼脂糖构建三维支架材料，模拟体内微环境动态培养干细胞，使干细胞维持自我更新、增殖和定向分化。专利公布号为102858381A的专利公开了一种细胞三维构建体及制备方法，以及用于组织修复，该发明使用生物相容性良好的天然或非天然聚合物包裹干细胞，形成细胞三维构建体。

上述专利将间充质干细胞包裹在支架材料中进行三维培养，支架材料的组织相容性和降解产物会对细胞活性产生影响。同时，支架材料的孔径和孔隙率应当与细胞相匹配，否则会影响细胞的生长和外界营养物质交换。在使用培养后的间充质干细胞时，若直接以三维构建体进行移植，支架材料降解后形成的空隙则难以填补；若将间充质干细胞从支架材料中释放，则会对间充质细胞造成损伤。

专利号为ZL201210410047.6的中国专利公开了一种诱导间充质干细胞成为无支架软骨的制备方法，将间充质干细胞高密度接种在15 ml离心管中，离心后静置培养形成细胞团块。但是，离心形成的细胞团块，其中心部位的细胞结合紧密，不利于营养交换，细胞容易发生坏死。此外，成软骨细胞诱导液的刺激方法单一，造成间充质干细胞的分化能力弱，形成的软骨细胞表型不稳定。

发明内容

本发明针对间充质干细胞包裹支架材料进行三维培养，三维构建体移植以及向软骨细胞分化效果不理想的技术问题，提供了一种自组装间充质干细胞团块的制备方法以及诱导间充质干细胞团块向软骨细胞分化的方法。本发明还给出了其在关节软骨缺损修复中的应用。本发明无需使用支架材料以实现间充质干细胞的高密度三维动态培养。

为了实现上述目的，本发明采取如下的技术方案：

一种自组装间充质干细胞团块，可通过下述方法制备：

步骤一，多孔培养板的包被

在无菌条件下，使用水凝胶包被多孔培养板；

步骤二，间充质干细胞的扩增培养

将间充质干细胞接种在包被后的培养板中，将间充质干细胞扩增培养至第三代；

步骤三，自组装间充质干细胞团块的形成

取步骤二培养的第三代间充质干细胞，用团块形成诱导液配制成间充质干细胞悬液，向步骤一包被的多孔培养板的每一孔中加入100～250μl间充质干细胞悬液，使每一孔中细胞数量为1×10⁵～1×10⁶个，每天换团块形成诱导液一次，将多孔培养板置于细胞培养箱中培养4～7天后，形成直径为500～600μm的间充质干细胞团块。

优选地，上述步骤一包被多孔培养板的方法为：在无菌条件下，向孔直径为6～7mm、孔深度为10～12mm、底部为U型的多孔培养板的每一孔中加入30～60μl水凝胶，待凝胶凝固后，形成包被的多孔培养板。

所述水凝胶可以选用琼脂糖凝胶、海藻酸钠凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、PLGA凝胶中的任一种。PLGA凝胶即聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)。为避免水凝胶在包被前凝固，应该根据所选水凝胶凝固特征的不同，选择适宜的操作时机。本发明最优选的水凝胶是琼脂糖凝胶，使用浓度为1%～2%（W/V）。