[发明专利]一种组织工程角膜的制备方法

权利要求书

1.一种组织工程角膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，

步骤一、动物源性角膜的选取和前处理：

选取包含有前弹力层的动物源性角膜，将其置于添加抗生素的、温度在2～30℃的去离子水中浸泡8～24h，待所述动物源性角膜厚度溶胀到2～5倍厚度后，该动物源性角膜的上皮细胞层会由于后弹力层胀起而脱落，同时抗生素的使用，可以有效去除该动物源性角膜组织的细菌，获得无菌的、去除了上皮细胞层的动物源性角膜组织材料；

步骤二、角膜各层的分离：

将步骤一制备所得的动物源性角膜组织材料置于角膜切削设备中，切削获得前弹力层组织片、基质层组织片和后弹力层组织片，实现角膜各层的分离；

步骤三、将步骤二制备所获得的前弹力层组织片、基质层组织片和后弹力层组织片去抗原、病毒灭活处理后，采用质量百分比浓度为60%～95%的甘油对去抗原、病毒灭活处理后的前弹力层组织片、基质层组织片和后弹力层组织片进行脱水处理，然后在2～30℃的温度条件下，使前弹力层组织片、基质层组织片和后弹力层组织片恢复至溶胀前的生理状态，同时置于所述甘油中保持待用；

步骤四、制备细胞混悬液：

将人角膜缘组织置于25～37℃预热的胰酶溶液中消化细胞，胰酶浓度为0.1%～0.25%，消化时间为1～10min，后采用人血清终止消化，800～1200rpm离心收集细胞，随后采用溶液A将收集的细胞制备成细胞混悬液，待用；

所述溶液A是体积百分数为10%～30%的人血清、胶原溶液和透明质酸溶液中的任一种或两种的混合或三种的混合溶液；

所述细胞混悬液的细胞浓度为1×10⁴至2×10⁵个细胞每毫升；

步骤五、组织工程角膜的构建：

将步骤四制备的细胞混悬液涂布于步骤三制备的前弹力层组织片、基质层组织片和后弹力层组织片上，在25～37℃下静置至少30min后，让细胞有效附着于弹力层组织片、基质层组织片和后弹力层组织片的表面；

再将表面上附着了细胞的前弹力层组织片、基质层组织片和后弹力层组织片，以后弹力层组织片在下、基质层组织片居中和前弹力层组织片在上的顺序堆叠，同时对其进行交联和加固以固定各层，制得所述组织工程角膜。

2.如权利要求1所述的组织工程角膜的制备方法，其特征在于：所述抗生素为青霉素类、头孢菌素类、链霉素、庆大霉素、红霉素和白霉素的一种或多种混合。

3.如权利要求1所述的组织工程角膜的制备方法，其特征在于：所述前弹力层组织片和后弹力层组织片的切削厚度为所述动物源性角膜组织材料的厚度的5%～10%。

4.如权利要求1所述的组织工程角膜的制备方法，其特征在于：所述去抗原后的前弹力层组织片、基质层组织片和后弹力层组织片的DNA残留量在1～100mg/ml之间，其脂性物质含量应在1%以下。

5.如权利要求1所述的组织工程角膜的制备方法，其特征在于：所述细胞混悬液的pH值在5～9之间，细胞混悬液300nm至800nm的透光率在80%以上，细胞混悬液的渗透压在200～380mOsmol/L之间。

6.如权利要求1所述的组织工程角膜的制备方法，其特征在于：所述人血清是接收角膜移植或修复的患者自身制备的血清或正常健康的人通过采血而制备的，并进行补体灭活操作后的人血清。

7.如权利要求1所述的组织工程角膜的制备方法，其特征在于：所述交联是指采用核黄素光催化的交联操作，在后弹力层组织片与基质层组织片之间、基质层组织片和前弹力层组织片之间滴加核黄素溶液，并充分去除层间气泡，使后弹力层组织片、基质层组织片和前弹力层组织片中的核黄素溶液达到15～50μg/g的浓度，再通过波长在350～390nm范围内的光照射，进行光催化的交联。

8.如权利要求1所述的组织工程角膜的制备方法，其特征在于：所述加固是采用生物蛋白胶在所构建的后弹力层组织片与基质层组织片的层间边缘处、基质层组织片和前弹力层组织片的层间边缘处进行黏连，所述的生物蛋白胶是纤维蛋白原浓缩液和凝血酶的混合液。

9.如权利要求1所述的组织工程角膜的制备方法，其特征在于：所述动物源性角膜为猿、猴子、猩猩、猪、牛和鸡的角膜中的任一种。