[发明专利]一种皮肤溃疡修复基质的制备方法

权利要求书

1.一种皮肤溃疡修复基质的制备方法，其特征在于：采用脱细胞、去抗原和增厚处理后的天然细胞外基质作为生物支架，复合种子细胞在天然细胞外基质表面形成具有2～10层的多层细胞的细胞膜，经冷冻干燥处理后即得皮肤溃疡修复基质；

所述种子细胞是自体或同种异体来源的成纤维细胞或干细胞；

所述的皮肤溃疡修复基质的制备方法，包括以下步骤：

1)步骤一、细胞外基质的制备：将完成脱细胞去抗原和灭活处理的胶原膜组织用碱液浸泡进行增厚处理，然后用0.01～0.05M PBS溶液进行清洗至pH为6～7为止，并用所述PBS溶液浸泡1～6小时得到细胞外基质，然后用10～25kGy钴60辐照灭菌后备用；

2)步骤二、培养基的配制：

2.1)、配制基础液：按9:1的体积比将DMEM/F12商用培养液与胎牛血清或新生牛血清混合为基础液；

2.2)、配制基础培养基：按500ml所述基础液标准加入胰岛素1～100ng，转铁蛋白1～50mg，亚硒酸钠1～30μg，氢化可松10～600μg，表皮细胞生长因子1～20μg，碱性成纤维细胞生长因子1～100ng，转化生长因子β1～100ng，维生素C1～100mg，配制成基础培养基；

2.3)、配制培养基：向所述基础培养基中分别添加牛垂体提取液10～30μg/ml、腺嘌呤1～50mg、HRG 50～300ng/ml和血小板衍生因子1～20ng/ml，分别配制成以下四种不同的培养基：

培养基a：基础培养基+牛垂体提取液10～30μg/ml；

培养基b：基础培养基+腺嘌呤1～100μg/ml；

培养基c：基础培养基+HRG 50～300ng/ml；

培养基d：基础培养基+血小板衍生因子1～20ng/ml；

其中，所述牛垂体提取液、腺嘌呤、HRG和血小板衍生因子的浓度为终浓度；

3)步骤三、种子细胞的分离和体外培养：采用组织贴壁法从所需的组织中进行种子细胞的分离，或采用酶消化法从所需的组织中进行种子细胞的分离，或用差速贴壁法从所需的组织中进行种子细胞的分离；

并用F12或MEM或DMEM或RPMI-1640培养基混合5％～20％的胎牛血清进行体外传代培养，培养温度为25～38℃，3％～7％的CO2浓度；

4)步骤四、接种细胞和三维培养：在无菌环境下，按1×104～10×106个/cm²的接种密度在所述步骤一制备的细胞外基质上进行细胞接种，接种时刺入所述细胞外基质0.2～1mm进行接种，每次注入0.1～1.0ml，针孔密度为0.1～0.5个/cm²，并在所述细胞外基质表面进行点状接种，然后通过轻微振荡使所述种子细胞均匀分布在所述细胞外基质表面；

在37℃、5％的CO₂培养箱中，使接种后的细胞外基质完全浸没于培养基a中，培养1～2天，之后更换培养基b，浸没所述接种后的细胞外基质，培养1～2天后更换为培养基c，培养基c液面与所述接种后的细胞外基质平齐，继续培养1～2天后更换为培养基d，同样浸没所述接种后的细胞外基质，培养1～2天；培养期间每天换液；

5)步骤五、冻干包装和灭菌：将所述步骤三培养完成的样品进行冻干，控制冻干程序以5～12℃/min的速率降至-80～-20℃，保持1～4小时后，冷冻干燥10～24小时，之后进行包装，再以10～25kGy钴60辐照灭菌后即得皮肤溃疡修复基质。

2.根据权利要求1所述皮肤溃疡修复基质的制备方法，其特征在于：所述碱液浸泡处理系指在室温条件下，用1M碱溶液浸泡5～30min，或用1‰～1％的次氯酸钠浸泡1～2小时，进行浸泡处理，使所述胶原膜组织的厚度增加2～7倍。

3.根据权利要求2所述皮肤溃疡修复基质的制备方法，其特征在于：所述碱溶液是氢氧化钠碱溶液、碳酸氢钠碱溶液，碳酸钠碱溶液和氢氧化钾碱溶液中的任一种。

4.根据权利要求2所述皮肤溃疡修复基质的制备方法，其特征在于：所述胶原膜组织的厚度增加3～5倍。