[发明专利]嗜血杆菌菌种保存方法

说明书

技术领域

本发明涉及临床微生物检验苛养菌菌种保存领域，尤其涉及一种嗜血杆菌菌种保存方法。

背景技术

目前，嗜血杆菌保存方法主要有甘油血清肉汤法、脱脂牛乳法、纸片法、真空冷冻干燥法，用真空冷冻干燥法保存嗜血杆菌效果虽佳，但此法操作繁琐、费时、费力，而且需要价格昂贵的冷冻真空干燥箱和真空泵等设备，给实际工作带来不便，而其余三种方法操作虽然简单，但嗜血杆菌存活期限1-6个月不等，而且未见生化性状及药敏特征是否改变的报道。

发明内容

本发明要解决上述现有技术存在的问题，提供一种嗜血杆菌保存方法，解决目前嗜血杆菌保存操作繁琐、费时费力，并且嗜血杆菌存活期限短的问题，也解决了目前羊血巧克力培养基无法有效培养嗜血杆菌的问题，满足嗜血杆菌菌种保存的需求。

本发明解决其技术问题采用的技术方案：这种嗜血杆菌菌种保存方法，包括如下步骤：

第一步，培养基制作，选取100ml甘油和100ml蒸馏水混合均匀制作成初级培养基，然后将初级培养基置入灭菌器中进行灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为15min，待灭菌器压力表的压力降到零后，立即取出初级培养基，此时，初级培养基的温度为95℃，然后在初级培养基中持续缓慢加入无菌脱纤维羊血25ml，获得甘油羊血巧克力汤，待甘油羊血巧克力汤冷却至室温后，分装到10ml无菌试管中，每支试管装5ml甘油羊血巧克力汤，获得巧克力培养基；

第二步，嗜血杆菌菌种保存，取嗜血杆菌标准菌株接入巧克力培养基，然后在CO₂环境、35℃温度中过夜培养，然后采用一支5ml甘油巧克力汤扩大培养制备成浓菌液，再分装到0.5ml的无菌试管中，接着立即置入到-35℃温度的冰箱中进行保存；

第三步，取用，取用时，将0.5ml的试管从冰箱中取出，然后置于35℃的培养箱中复溶5min，然后立即转移到巧克力培养基上，置于CO₂环境、35℃温度中过夜培养。

进一步的，第一步中的灭菌器采用干热灭菌器。

嗜血杆菌氧化还原酶系统不完善，对培养条件的要求较高，因此，其分离培养较为困难，生长时需要X因子和V因子两种辅助生长因子，破坏红细胞能够使X因子和V因子从红细胞中释放，用以培养嗜血杆菌，X因子指的是正铁血红素，V因子指的是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。