[发明专利]miR-34c在体外诱导骨骼肌细胞分化中的应用

说明书

本发明涉及miR‑34c在体外诱导骨骼肌细胞分化中的应用。本发明首次发现一种新的促骨骼肌细胞分化因子—miR‑34c，通过Western blot和免疫荧光染色技术检测miR‑34c对成肌细胞分化的影响，从而确定miR‑34c在骨骼肌发育中的作用，对预防和治疗骨骼肌相关疾病具有重要的意义。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及miR-34c在体外诱导骨骼肌细胞分化中的应用。

背景技术

MicroRNAs(miRNAs)是一类非编码的单链小RNA，其长度约为20～25nt，在物种进化中非常保守，它们在特定发育阶段或特定组织中表达。miR-34c是mir-34家族的一员，miR-34家族有3个成员(miR-34a，miR-34b，miR-34c)。其中，miR-34a由一个单独的初级转录产物转录生成，而miR-34b和miR-34c共用一个初级转录产物。在人类基因组中，miR-34a位于1号染色体上，miR-34b和miR-34c位于11号染色体上。60％以上的人类编码蛋白的基因都有miRNA的保守靶位点，因此，miRNA有多种多样的生物学功能，包括信号转导、组织分化、机体的发育等。

骨骼肌由中胚层的间充质干细胞发育而来，是胚胎发育过程中最早形成的组织之一。骨骼肌的发育受到一系列调控因子的精确调控，其中肌肉生成调控因子(MRFs)发挥了核心作用，此外，Wnt、Notch、TGF-β等信号通路也起到了主要的作用。除了上述调控因子外，miRNA在骨骼肌的损伤修复、卫星细胞的增殖与分化、成肌细胞的增殖与分化等骨骼肌的发育进程中发挥了重要的作用。

自1993年发现第一个miRNA后，随后20年中已有10000多个miRNA被陆续发现。它们在细胞增殖、分化、凋亡等生物学进程中发挥了关键的作用。MiRNA调控的多样性，使它们与很多人类疾病相关。因此了解miRNA在肌肉发育过程的作用，对预防和治疗骨骼肌相关的疾病具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供miR-34c在体外诱导骨骼肌细胞分化中的应用。

为了实现本发明目的，本发明提供一种新的促骨骼肌分化因子—miR-34c。

本发明还提供miR-34c在体外诱导骨骼肌细胞分化中的应用，其是利用脂质体(例如脂质体2000)在成肌细胞中瞬时转染miR-34c mimics，待细胞汇合度达到85％-95％(优选90％)时，将细胞用分化培养基培养，诱导细胞分化。

本发明中涉及的miR-34c mimics是指miR-34c拟似物，购自上海吉玛制药技术有限公司。所述miR-34c mimics的序列为：

正义链：5’-AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC-3’(SEQ ID No.1)

反义链：5’-AAUCAGCUAACUACACUGCCUUU-3’(SEQ ID No.2)

本发明中涉及的成肌细胞为小鼠成肌细胞C2C12。

所述分化培养基培养为含有2％马血清和1％青霉素/链霉素的DMEM高糖培养基。

用分化培养基培养的条件为：37℃，5％CO₂。

在细胞分化第3天时，提取蛋白质，用Western blot技术检测肌球蛋白重链(MYHC)的表达，发现转染miR-34c mimics的细胞MYHC的表达量高于转染Negative Control(NC)mimics(SEQ ID No.3和4)的细胞；另外，在细胞分化第3天时，取细胞样品，进行细胞免疫荧光染色，发现转染miR-34c mimics的细胞中MYHC阳性细胞数多于转染NC mimics的细胞。以上结果说明过表达miR-34c能促进C2C12细胞的分化。

本发明还提供含有miR-34c mimics的转基因细胞系、工程菌。