[发明专利]一种基于RMCE技术的转基因方法

说明书

技术领域

本发明属于基因修饰技术领域，具体涉及一种基于RMCE技术的转基因方法。

背景技术

现有的转基因技术，多采用显微注射，其具有试验周期短、目的基因片段长度可达100kb、整合效率高等优点，但还是存在诸多不足和缺点，如外源基因是以随机插入的方式进入受体基因组，其整合位点和拷贝数都无法精确掌握，有可能引起基因沉默，更改细胞或组织特异性基因的表达水平，甚至影响整个基因组的表达情况，从而造成宿主优良性状的丢失，甚至有致死性状的出现。

重组酶介导的盒式交换技术(RecombinaseMediatedMassetteExchange，RMCE)与同类方法相比，具有定点、高效、简单而又可能对基因组进行反复修饰等特点，因而在研究基因功能、分析顺式作用成分以及构建各种转基因动物、建立人类疾病动物模型等方面具有很大的应用价值。

发明内容

发明目的：为了克服上述转基因技术的不足和缺点，研制基于RMCE技术的转基因技术，为科学研究和市场应用提供前期基础，本发明所要解决的技术问题是提供了一种基于RMCE技术的转基因方法。

本发明解决了现有转基因技术插入位置及拷贝数不确定、引起基因沉默、更改细胞或组织特异性基因的表达水平，甚至会影响整个基因组的表达情况。本发明可在短时间内、高效率、精确的获得定点插入的转基因鼠。

技术方案：为了解决上述问题，本发明的技术方案是一种基于RMCE技术的转基因方法，包括以下步骤：

1)构建载体：以Rosa26载体为框架，加上Lox2272位点或Attp70位点、广谱性启动子、荧光蛋白基因、LoxP位点或Attp70位点、Frt位点、筛选标记和DTA终止区域；

2)载体测序正确后，电转到ES细胞中，用含有抗生素的培养基进行筛选，获得阳性ES细胞；

3)PCR或SouthernBlot再次验证；

4)将带有Flp重组酶的质粒转到阳性ES细胞中，获得没有筛选标记的阳性ES细胞；

5)将验证正确的阳性ES细胞显微注射到小鼠的囊胚中，而后转移至代孕母鼠中，获得含有荧光标记的RMCE工具鼠。

其中，上述启动子为EF1α、CAG、CMV或其他所有广谱性表达的强启动子。

其中，上述荧光蛋白为eGFP、mCherry、RFP、BFP或其他所有发挥追踪作用的蛋白。

其中，上述筛选标记为Neo、Puro或其他所有能达到筛选目的的蛋白。

有益效果：本发明相对于现有技术，具有以下优点：

1)操作简单、周期短，节省时间和成本；

2)只需确定目的基因的序列信息，即可实现基因的定点插入；

3)减少随机插入引起的非必要的基因沉默；

4)避免基因突变造成的胚胎过早死亡等。

本发明的转基因技术，是由RMCE与重组酶技术融合而来，其既有RMCE技术的优点，又能实现基因的定点插入，转基因效率高、同时也减少了基因的随机插入带来的毒性。

本发明只需要设计简单的载体，即可实现转基因鼠的构建；利用此工具鼠可以在短时间内高效、特异性的完成基因的定点插入，为人类疾病的研究提供理论依据和动物模型。另外此发明也可作为临床和医药研究的配套技术，为人类健康保驾护航。

附图说明

图1：实施例1中工具鼠构建的载体骨架；

图2：实施例2中工具鼠构建的载体骨架；

图3：PCR扩增获得720bp的eGFP片段和1179bp的EF1α片段琼脂糖凝胶电泳图；

图4：EF1α菌落PCR结果琼脂糖凝胶电泳图；

图5：eGFP菌落PCR结果琼脂糖凝胶电泳图；

图6：5’armPCR鉴定结果琼脂糖凝胶电泳图；

图7：3’armPCR鉴定结果琼脂糖凝胶电泳图；

图8：荧光显微镜检测ES细胞图片；

图9：PCR扩增获得1507bp的目的基因片段琼脂糖凝胶电泳图；

图10：菌落PCR扩增获得748bp的片段琼脂糖凝胶电泳图；

图11：PCR验证扩增获得659bp的片段琼脂糖凝胶电泳图；

图12：PCR扩增获得672bpCMV片段、720bp的eGFP片段琼脂糖凝胶电泳图；

图13：CMV菌落PCR获得513bp的扩增片段琼脂糖凝胶电泳图；

图14：eGFP菌落PCR获得615bp的扩增片段琼脂糖凝胶电泳图；