[发明专利]卷烟烟气总粒相物诱导细胞氧化应激GSH/GSSG的测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及到卷烟烟气总粒相物的体外毒理学研究，具体来说是一种检测卷烟烟气总粒相物诱导细胞氧化损伤后胞内谷胱甘肽还原态与氧化态比值（GSH/GSSG）的测定方法。

背景技术

卷烟烟气是一种复杂的混合物，已报道的化学成分超过8000种，并且部分化学成分显示出一定的氧化性。当细胞或组织暴露在卷烟烟气中时，细胞体系的氧化/抗氧化平衡被打破，细胞产生氧化应激，并最终导致机体产生病理性损伤。当细胞发生氧化应激时，细胞内活性氧族（ROS）以及活性氮族（RON）增加，会对脂质、蛋白质以及DNA等产生不同程度的氧化损伤，同时激活细胞内抗氧化物质如细胞外超氧化物歧化酶（EC-SOD），还原型谷胱甘肽（GSH），过氧化氢酶等。在这些抗氧化物中，GSH在细胞内发挥重要的抗氧化作用。GSH是细胞内含量丰富的硫醇式缩氨酸，对维持细胞氧化还原平衡发挥重要作用，被广泛作为细胞氧化应激标志物。针对细胞氧化应激状态下胞内GSH/GSSG的检测，用荧光测定法较易于操作，但检测结果易受干扰；而采用高效液相色谱法分析时，样品前处理过程耗时长，并且对于大样品的检测不方便，所用的柱子也较特殊。当前，较常用的检测方法是酶循环法，该方法最初由Owen和Belcher提出（Owens CW, Belcher RV. A colorimetric micro-method for the determination of glutathione. Biochem J. 1965;94:705-711），之后由Tietze（Tietze F. Enzymic method for quantitative determination of nanogram amounts of total and oxidized glutathione: applications to mammalian blood and other tissues. Anal Biochem. 1969;27(3):502-522.）和Griffith（Griffith OW. Determination of glutathione and glutathione disulfide using glutathione reductase and 2-vinylpyridine. Anal Biochem. 1980;106(1):207-212.）进行了改进。但该方法仍然存在一些不足之处：首先，其特异性不够高，主要是由于5,5'-二硫代双-2-硝基苯甲酸（DTNB）可与许多含活性巯基基团的物质反应，同时，检测的是谷胱甘肽总量，不能区分出GSH和GSSG；此外，该方法对样品的处理时间要求严格，从开始准备样品到检测，时间不能超过3分钟, 否则将影响测定结果。

发明内容

本发明的目的正是针对上述存在的问题对部分操作步骤进行了改进，基于酶循环法建立一种卷烟烟气总粒相物诱导细胞氧化应激时胞内GSH/GSSG的检测方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种卷烟烟气总粒相物诱导细胞氧化应激GSH/GSSG的测定方法，包括以下工艺步骤：

1)配制实验试剂：包括（1）生长培养液，（2）磷酸缓冲盐溶液（PBS），（3）1 %的胰酶，（4）三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液（SBB），（5）掩蔽剂，（6）脱蛋白质剂，（7）GSSG标准溶液，（8）反应混合液，（9）还原型辅酶Ⅱ（NADPH）溶液，（10）阴性对照；

２）制备卷烟烟气总粒相物：将捕集有卷烟烟气总粒相物的剑桥滤片直接放入锥形瓶中，加入适量体积的DMSO，萃取捕集在剑桥滤片上的主流烟气粒相组分，室温振荡20 min，去滤片过滤除菌，制备烟气总粒相物浓度为10 mg/ml的样品储存液，于-80℃保存。

３） 细胞接种培养：细胞进行消化以后，制备细胞悬液，6孔板的所有孔中每孔加入2.0 mL生长培养液 + 450 μL细胞悬液，于37 ℃、5 % CO₂条件下培养24 h；

４）卷烟烟气总粒相物染毒：用生长培养液将卷烟烟气总粒相物储存液调整到不同浓度，终浓度设置至少包括2个非零浓度，使细胞存活率在70 %以上，培养24 h后的细胞，吸去培养液，6孔板中阴性对照组每孔加入2.5 mL 20 μg/mL DMSO生长培养液，实验组每孔加入2.5 mL含有不同浓度卷烟烟气总粒相物的生长培养液，于37 ℃、5 % CO₂条件下培养24 h；