[发明专利]一种新的农杆菌介导的大白菜原位转基因方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及农杆菌介导的大白菜原位转基因方法。

背景技术

1、大白菜(Brassicarapassp．pekinensis)是十字花科芸薹属(Brassica)中最重要的蔬菜作物之一，是我国栽培面积最大、分布最广、人们普遍喜爱的蔬菜，被称为“当家菜”。长期以来，我国大白菜主要是通过杂交育种进行品种改良。但传统的杂交育种方法，存在育种年限长、成本高、亲本自交多代生活力易退化等诸多弊端，随着组织培养和DNA重组技术的建立和不断完善，转基因技术已经成为改良农艺性状，解决农业生产难题的重要手段。目前以农杆菌介导的转化方法主要有借助细胞组织培养技术的离体转化和直接在植株上进行的原位渗入转化，例如花粉管通道法、真空渗入法等。

目前，大白菜遗传转化最常使用的方法仍是利用普通的组培方式进行的农杆菌介导法，即将要转化的植株的子叶等外植体作为转化受体在预培养基上培养生长，然后浸入携带外源基因的农杆菌菌液中3～5min，在无菌滤纸上吸干菌液。首先，被浸染的外植体在共培养基上培养一定的时间，以确保外源基因充分整合到染色体上；其次，被浸染的外植体转移至恢复培养基，恢复培养基内含有一定浓度的抑制细菌生长的抗生素（有氨苄青霉素、羧苄青霉素、利福平等）；最后，外植体被转移至含有一定浓度选择性抗生素的选择培养基，筛选抗性芽，诱导生根，再生植株，经抗性分子鉴定获得转基因植株。近年来，大白菜转基因研究随着其高频植株再生体系的建立和不断完善取得了显著进展。例如朱常香等、杨广东等、王关林等、王洋等、张艳萍等、杨广东等分别将抗芜菁花叶病毒基因、修饰豇豆胰蛋白酶抑制剂基因、抗菌肽基因、白细胞介素一2基因、硝酸还原酶基因、雪花莲凝集素基因GNA等用农杆菌介导法导人大白菜基因组，获得了转基因植株。

据近几年研究报道，以农杆菌介导的大白菜遗传转化所使用的受体主要是无菌苗的子叶或下胚轴，都是体细胞组织，具有两套染色体，外源基因同时插入同源染色体相同座位的可能性极小，因而转化植株常常是杂合的，后代会发生分离。曹鸣庆等以小孢子作为遗传转化受体，得到了抗除草剂转基因植株。因为小孢子同时具备了单倍体和单细胞两个特性，转化体经加倍后即可成为纯合的二倍体。

但是，由于大白菜组织培养难度较大，再生体系较难建立，一定程度上制约了转基因技术在大白菜育种中的应用，因此，寻求不依赖于组织培养途径的转化方法，是许多从事基因工程研究的研究者非常关注的事情。花粉管通道法是一种以生殖细胞作为外源DNA的受体细胞，借助开花植物复杂的有性生殖过程，获得转基因植株的方法。其原理主要是授粉后使外源DNA能沿花粉管渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞。据统计，外源DNA直接导入植物技术已相继在近30种作物上获得成功，在水稻、小麦等经济作物上的应用例子比较多，而在蔬菜育种上的应用相对少一些，尤其对一些蔬菜小品种报道不多。例如王雷等人通过花粉管通道法介导il-4基因转化大白菜，“哈白二号”大白菜在花期授粉后24h左右进行转化，转化率达1.15%。

原位渗入转化法最早获得成功是Feldmann和Marks利用农杆菌侵染刚刚萌发的种子，从其后代种子中筛选出了抗性株，并通过分子杂交进行了验证。而真空渗入转化法作为原位渗入转化的一种，它是由Bechtold等将植物病理学中用来辅助植物病毒进入植株的方法，应用到了拟南芥植株的农杆菌基因转化上，其转化频率较种子转化提高了3～4倍。该方法避开了组织培养的过程，以生长中的植株作为转化受体，从后代种子中直接筛选抗性株，为植物的转基因工作开辟了新的途径。但遗憾的是目前这种方法除在拟南芥中被广泛应用外，其他植物中仅在不结球白菜、苜蓿中有成功转化的报道。曹鸣庆等将不结球白菜利用真空渗入法转化获得了转基因白菜。刘凡等利用农杆菌介导的真空渗入转化法将马铃薯蛋白酶抑制剂基因(pinII)导人不结球白菜“49菜心”中，获得抗虫性材料。

尽管大白菜转基因技术取得一些进展，但由于离体转化比较困难，大白菜农杆菌介导的离体转基因方法受到制约，花粉管通道法和真空渗入法仅在不结球白菜上试验成功，在接球大白菜上未见报道，且这些方法也存在一些弊端，实践上迫切需要发展一些更高效、简易、快捷、重复性好的技术。