[发明专利]使用染色体非整合型病毒载体制造经初始化的细胞的方法

说明书

本发明的目的是提供用于简便且有效地制造染色体上未整合外源基因的ES样细胞的载体。发现了使用染色体非整合型病毒载体从体细胞制作ES样细胞的方法。上述制作的ES样细胞的染色体上未整合外源基因，因而不仅适合用于利用本细胞进行的试验、研究，还可以在疾病的治疗中避免免疫排斥问题和伦理层面的问题。

本发明是申请日为2009年07月16日、申请号为200980136168.2、发明名称为“使用染色体非整合型病毒载体制造经初始化的细胞的方法”的中国发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及经初始化的细胞的制造方法、通过该方法制造的细胞、以及该方法中使用的组合物等。特别是，本发明涉及由分化的体细胞制造多能干细胞的方法、以及通过该方法制备的多能干细胞。

背景技术

胚胎干细胞(ES细胞)是从哺乳动物胚泡的内部细胞团建立的干细胞，其在保持了分化成所有细胞的能力(分化多能性)的同时，还能够无限增殖。由于该特性，将从ES细胞大量诱导、制备的心肌细胞、神经细胞移植给心肌梗塞、帕金森病患者来进行治疗的干细胞疗法备受期待。此外，其作为病理、药理基础研究或药物研发的开发工具的应用也令人期待。但是，该ES细胞存在利用和牺牲人受精卵这样的伦理问题。此外，还存在有限的供体受精卵的组织相容性抗原与患者不一致这样的免疫排斥问题。另一方面，生物体的各组织中存在神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞等组织干细胞。组织干细胞不使用受精卵，因此少有或者没有伦理问题；此外，由于可以使用患者自身的细胞，因而可以避免免疫排斥反应。但是，组织干细胞的性质并不一定清楚，因而分离困难，且数量极少。而且，组织干细胞的增殖能力、分化能力有限，远不能与ES细胞相比。如果能够采取某种手段将组织干细胞、分化细胞等体细胞转变为与具有高增殖能力和分化多能性的ES细胞类似的细胞(称为ES样细胞)，对临床应用等而言，这种ES样细胞将成为理想的干细胞。

具体地，采集哺乳动物的细胞、特别是患者的体细胞(皮肤、胃、肺等组织、血液细胞等)，用核初始化因子(nuclear reprogramming factors)(诱导核初始化(nuclearreprogramming)的因子)刺激培养的这些细胞，制作ES样细胞(也称“人工多能干细胞”、“诱导多能干细胞(iPS细胞)”或“胚胎干细胞样细胞”)。可以期待将该制作的ES样细胞直接或以细胞库的形式储备而作为干细胞应用于临床、或者用于包括药理、病理在内的基础研究(专利文献1)。此外，还可以使用从患者建立的人工多能干细胞进行药效确认实验。

核初始化因子(nuclear reprogramming factors)包括例如Oct基因、Klf基因、Myc基因、Sox基因、Nanog基因、Lin28基因、TERT基因以及SV40 LargeT基因等(专利文献2、非专利文献1～7)。

例如，已知可以使用下述4种重组病毒载体，从上述体细胞制作上述ES样细胞(非专利文献1～7)。当临床应用上述制作的ES样细胞时，有可能能够避免免疫排斥问题、伦理层面问题。

(1)包含Oct3/4基因的γ逆转录病毒载体或慢病毒载体(以下将其合称“逆转录病毒载体”)

(2)包含Klf4基因的逆转录病毒载体

(3)包含c-Myc基因的逆转录病毒载体

(4)包含Sox2基因的逆转录病毒载体

上述专利文献、非专利文献如下。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:国际公开WO2005/080598

专利文献2:国际公开WO2007/069666

非专利文献

非专利文献1:Cell.2007 Nov 30；131(5):861-872