[发明专利]属于GH3家族的耐热性β-木糖苷酶

说明书

本发明提供一种耐热性β‑木糖苷酶，其具有由下列(A)、(B)或(C)构成的β‑木糖苷酶催化区域：(A)由序列号1所示氨基酸序列构成的多肽；(B)由序列号1所示氨基酸序列中的至少一个氨基酸的缺失、取代或添加而形成的氨基酸序列所构成的、并且至少在85℃且pH6.0的条件下具有以对硝基苯基‑β‑D‑吡喃木糖苷为底物的水解活性的多肽；(C)由与序列号1所示氨基酸序列具有80％以上序列一致性的氨基酸序列构成的、并且至少在85℃且pH6.0的条件下具有以对硝基苯基‑β‑D‑吡喃木糖苷为底物的水解活性的多肽。

技术领域

本发明涉及一种耐热性β-木糖苷酶、编码上述耐热性β-木糖苷酶的多核苷酸、用于表达上述耐热性β-木糖苷酶的表达载体、整合了上述表达载体的转化体、以及使用上述耐热性β-木糖苷酶的木质纤维素分解产物的制造方法。

本申请要求基于2014年8月4日在日本申请的特愿第2014-158650号的优先权，并在本文中引用其内容。

背景技术

除了对运输用能源供应的担忧之外，由于全球变暖和大气污染等环境上的问题，近年来，石油替代能源的开发成为非常重要的课题。植物生物质是地球上最丰富的可再生能源，作为石油替代资源而备受期待。作为植物生物质的主要成分的木质纤维素为纤维素、半纤维素(包含木聚糖、阿拉伯聚糖和甘露聚糖)等多糖类，以及木质素。这些多糖类被各种糖苷水解酶水解为葡萄糖或木糖等单糖后，用作生物燃料或化学品原料。

具有复杂结构的木质纤维素是难分解性的，难以用单一的酶分解或糖化(hydrolysis)。因此，对于多糖类中的纤维素的水解，通常需要糖苷水解酶中的内切葡聚糖酶(内切-1,4-β-D-葡聚糖酶，EC 3.2.1.4)、外切型纤维二糖水解酶(1,4-β-纤维二糖糖苷酶(cellobiosidase)或纤维二糖水解酶，EC 3.2.1.91、EC 3.2.1.176)、β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)这三种酶。另一方面，半纤维素的构成因植物的种类而异，例如，在阔叶树和草本植物中，木聚糖构成了主要成分。对于木聚糖的水解，需要木聚糖酶(内切-1,4-β-木聚糖酶，EC 3.2.1.8)、β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)。β-木糖苷酶对通过木聚糖酶水解半纤维素生成的低聚糖进行水解，是涉及单糖生成工艺的水解酶之一。

在以往的以木质纤维素为资源的生物乙醇的制造中，以乙醇的高能效转化为目的，尝试了基于高固液比(30～60％的固液比)的糖化处理(hydrolysis process)。这种基于高固液比的木质纤维素的酶糖化，生物质糖化液的粘性高，难以进行木质纤维素的水解反应。因此，通过使用耐热性酶在例如80℃以上的高温下进行木质纤维素的酶解糖化处理，除了加快水解反应速度之外，降低了生物质糖化液的粘性，从而有望实现缩短糖化反应时间并降低酶量。因此，对于各种糖苷水解酶，期望开发耐热性更优异的酶。

大多数耐热性糖苷水解酶可以通过如下方式获得：对生存于高温环境下的嗜热性微生物进行分离鉴定，从这些分离培养的微生物中克隆基因，确定DNA序列后，利用大肠杆菌或丝状真菌等表达而获得。例如，专利文献1公开了来源于丝状真菌的β-木糖苷酶，专利文献2公开了在30℃表现出酶活性的、来源于丝状真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)的β-木糖苷酶。专利文献3中公开了在pH5.5以下、50℃以上表现出酶活性的、来源于酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)的β-木糖苷酶。专利文献4公开了在45℃表现出酶活性的、来源于解纤维顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)的β-木糖苷酶。另外，非专利文献1～6报道了最适温度为60℃左右的、分离自特定细菌或丝状真菌的β-木糖苷酶。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：特表平第11-507837号公报

专利文献2：特开平第11-313683号公报

专利文献3：特表第2011-523346号公报