[发明专利]检测呋喃唑酮代谢物的单抗、ELISA方法及试剂盒

说明书

本发明属于兽药残留分析和免疫分析技术领域,具体涉及一种检测呋喃唑酮代谢物的单抗，ELISA方法及试剂盒。本发明主要包括半抗原、免疫原和包被原的合成，单克隆抗体的制备以及ELISA方法的建立。本发明的试剂盒主要由抗呋喃唑酮代谢物AOZ的单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG、包被有与AOZ单克隆抗体特异性结合的包被原的酶标板组成。本发明的酶联免疫试剂盒灵敏度好，性价比高，适用于水产品中呋喃唑酮代谢物AOZ的残留检测。

技术领域

本发明属于兽药残留分析技术领域，具体涉及一种检测呋喃唑酮代谢物的单克隆抗体(单抗)，ELISA(酶联免疫)方法及试剂盒。

背景技术

呋喃唑酮属于硝基呋喃类药物，因其内服后难吸收，肠中浓度高而血中浓度低，故适用于各种肠道感染的治疗。该类药物对畜禽有一定毒性，大剂量或长期连续使用，易出现毒性反应，表现为厌食、腹泻、胃肠出血、周围神经炎、兴奋、惊厥、瘫痪等，中毒严重时可引起动物死亡。呋喃唑酮在体内代谢迅速，其代谢产物3-氨基-2-恶唑烷酮(AOZ)能与蛋白质结合，形成比原药化合物更稳定的蛋白结合物。这些代谢物可以在弱酸性条件下从蛋白质中释放出来，因此当人类吃了含有硝基呋喃类抗生素残留的食品，这些代谢物就可以在人类胃液的酸性条件下从蛋白质中释放出来被人体吸收而对人类健康造成危害。欧盟已于1995年禁止在食用动物中使用硝基呋喃类抗生素，我国也于2002年颁布了禁止使用硝基呋喃类抗生素的禁令。

为确保动物源性食品的安全和对外出口贸易的发展，建立准确可靠，灵敏度高的定性定量方法是十分必要的。在最初的时候多数国家对呋喃唑酮的监控是通过检测原形药物的残留，由于原形药物的不稳定性和检测监控的困难，研究员开始着手研究和寻找能够代替原形药物进行检测的残留标示物。2000年，欧委会提出了要要发展两种不同类型的筛选试验和一种确证试验来提高欧盟各药残实验室的检测和监控能力。于是，酶联免疫吸附试验(ELISA)方法诞生，并以其高通量、高灵敏度、低检测限、操作简单、耗费少的诸多优点被普及到残留检测的筛选工作。

2004年，Cooper等设计出AOZ半抗原，得到第一株多克隆抗体，采用直接ELISA方法对衍生物进行特异性检测，最低检测限为0.1μg/kg，定量限0.4μg/kg。2005年，Diblikova等用相同的半抗原免疫小鼠，获得AOZ特异性单克隆抗体，用于动物组织中AOZ残留的检测，检测限为0.3μg/kg，与LC-MS/MS对AOZ的检测结果有高度相关性。2008年，常超等对鱼、猪、鸡组织用苯甲醛作为衍生介质，将AOZ衍生成为N-苯亚甲基-3-氨基-2-噁唑烷酮，用间接ELISA方法进行检测，用磷酸盐缓冲液做标准曲线进行回归分析，得到组织检测限均小于0.5μg/kg。

呋喃唑酮残留检测的仪器方法日臻成熟，LC-MS/MS的应用大大提高了检测灵敏度，通常将其作为确证手段。ELISA试剂盒基于抗原抗体的特异性结合反应，具有常规理化分析技术无可比拟的高选择性和高灵敏度等特点，非常适于基质复杂、痕量残留的分析，是理想的残留筛选分析方法之一，是目前世界各国推行并实施的高通量筛选方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种能识别呋喃唑酮代谢物的单克隆抗体，利用该单克隆抗体，建立一种能呋喃唑酮代谢物(AOZ)残留检测的ELISA(酶联免疫方法)及试剂盒与应用。

本发明通过以下技术方案实现：

申请人通过制备，得到一种能够识别呋喃唑酮代谢物(AOZ)的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC NO：C2015129的杂交瘤细胞株SC20150701A所分泌的，该杂交瘤细胞株被命名为杂交瘤细胞株SC20150701A，于2015年7月20日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC NO：C2015129。