[发明专利]用于卷烟烟气总粒相物细菌回复突变性的检测方法

说明书

技术领域：

本发明涉及卷烟烟气总粒相物致突变性的检测方法，属于烟草及烟草制品烟气安全性生物学评价技术领域。

背景技术：

现今，化学物质及其污染物对人体的潜在危害越来越受到社会的普遍关注与重视。B．N．Ames等于1975年建立并不断发展完善的沙门氏菌回复突变试验（Ames试验）被世界各国及组织广为采用，是目前国际公认的检测新药、食品添加剂,食品包装材料及化妆品等的致突变性的首选试验[1-3]。国际烟草科学研究合作中心CORESTA组织于2002年成立了卷烟烟气体外毒理测试工作组，经过工作组大量的文献调研及研究工作，该工作组推荐采用细菌回复突变试验(Ames试验)分别对受试物潜在的致突变性进行检测。该检测方法目前已经被国内外烟草公司广泛采用。

自Ames检测体系建立以来, 不断有学者对其进行了各方面的改进，Ames试验的准确性、有效性也得以不断提高。但至今该试验仍存在一些的不确定性因素，例如被检测体系中的组氨酸及其前体物(如多肽,蛋白质等)的量对Ames试验结果存在重要影响，因为它们可以支持his-缺陷型细胞生长和分裂,增加最终回复子菌落数，从而造成假阳性；Ames试验所用的沙门氏菌属于原核生物缺少代谢活化系统，故Ames试验中需加入S9混合液作为代谢活化系统，该活化体系活性的强弱可能会对试验结果产生影响；除此之外，由于Ames试验是对产生回复突变的菌落数进行计数，检测使用菌的量过低可能会导致受试物诱变能力表现不完全。食品安全性毒理学评价程序中[1]中对组氨酸浓度设定为0.5mmol/L，S9混合液浓度为10%（V/V），受试菌浓度为不少于1×10⁹个/ml—2×10⁹个/ml,用上述反应体系检测卷烟烟气总粒相物，在自发回变菌落数与阳性对照组均正常时，受试物检测所得剂量-效应曲线的线性关系不佳。这可能是由于以上试验体系在组氨酸、S9混合液、受试菌浓度这三个重要参数的设定上对组氨酸和S9混合液的使用浓度给定了一个确定的值，而在对受试菌的使用量上只对使用量的下限进行了限定，当受试菌浓度过高时可能会对检测结果产生影响。

重要参考文献：

1.中华人民共和国卫生部.GB15193-2014食品安全性毒理学评价程序[S]。

2.中国食品药品监督管理局.YY/T0127.10-2009口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验(Ames试验) [S]。

3.中华人民共和国卫生部.GB7919-87化妆品安全性评价程序和方法[S]。

发明内容：

本发明的目的是克服现有技术存在的问题，提供一种用于卷烟烟气总粒相物细菌回复突变的检测方法。

本发明针对上述技术问题，对组氨酸浓度、S9浓度、菌浓度三个重要因素进行了综合研究，研究结果表明三个影响因素之间存在协同作用，并不是在某个限量范围内对三个因素进行任意组合就能得出较好结果。

本发明对试验体系中组氨酸浓度、S9浓度、菌浓度三个重要试验因素参数组合进行了改进，具体为：

组合1：组氨酸浓度为1mmol/L、S9浓度为10%（V/V）、菌液OD₆₀₀下吸光值为2.0×10⁹个/ml。

组合2：组氨酸浓度为0.5mmol/L、S9浓度为20%（V/V）、菌液OD₆₀₀下吸光值为2.0×10⁹个/ml。

本发明方法与现有技术方法相比，优点在于：综合考察了三个重要参数之间的协同作用，而不是单一的对某个参数进行调整，即保证了试验的灵敏度，也能够使剂量效应关系在所检测剂量范围内呈现较好的线性关系。在降低假阳性率的同时准确的反映受试物的致突变性。

具体实施方式：

下面将结合具体实例对本发明做详细描述，但并不是对本发明的限制。

实施例一：

用于肯塔基参比卷烟3R4F卷烟烟气冷凝物致突变性的检测

1.卷烟烟气总粒相物（TPM）的制备

参照中华人民共和国国家标准GB/T 19609 -2004《卷烟用常规分析用吸烟机测定总粒相物和焦油》制备样品，样品浓度为10mg/ml。

2.底层培养基的配制

遵照GB15193.4-2014《食品安全性毒理学评价程序和方法》中鼠伤寒沙门氏菌试验标准配制。

3.顶层培养基的配制