[发明专利]一种用于检测HHV-6A/6B型的数字PCR绝对定量分型检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子诊断生物学领域，具体涉及一种用于检测HHV-6A/6B型的数字PCR绝对定量分型检测试剂盒及检测方法。

背景技术

疱疹病毒是一组具有包膜的DNA病毒，现已发现100多种以上。疱疹病毒在人群中的感染非常普遍，它主要侵染外胚层来源组织，包括皮肤、粘膜和神经组织，感染部位和引起的疾病多种多样，并有潜伏感染的趋向。感染后的常见症状为：神经节腺体、肾淋巴组织、淋巴组织热性疱疹；唇、眼、脑感染；生殖器疱疹水痘；带状疱疹单核细胞增多症，眼、肾、脑和先天感染传染性单核细胞增多症、Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌、婴儿急诊和其他一些如未知腹痛等病症。近年发现HHV-6还可以引起儿童病毒性脑炎，并可能导致死亡和严重的神经系统后遗症；HHV-6A和HHV-6B在病毒学和流行病学上具有显著差别，在引起脑炎的致病性上也存在差异，因此在临床诊断HHV-6感染时有必要进行准确的病原学分型。

诊断HHV感染的金标准方法是病毒培养分离，但是由于该方法检测周期较长，操作繁琐，对标本要求高，使其在临床上的应用受到限制。免疫诊断学方法包括HHV抗原抗体的检测，是目前实验诊断方法，然而在病毒抗原含量低时该方法的检测灵敏度低，且抗体的测定主要用于流行病学调查和原发性感染的回顾性诊断，对于恢复期或复发性感染的临床意义不大。因此，HHV的分子诊断对于快速、准确地诊断HHV感染，保证早期、合理治疗、降低HHV传染性和危害性具有重要的临床实用价值。

目前，HHV的分子诊断主要包括核酸杂交方法、PCR方法等。核酸杂交技术是利用HHV DNA某段特异序列合成或克隆互补性探针序列，进行HHV核酸检测。目前常用生物素、地高辛等非放射性标记探针进行核酸杂交检测；但是杂交步骤较为繁琐，大样本研究耗时较长，易导致交叉污染。目前常用的检测HHV DNA的PCR技术有普通PCR技术、多重PCR技术及荧光定量PCR技术等。普通PCR方法由于敏感度高，易因污染导致假阳性；多重PCR方法通过一次检测就可以检测多种病毒，但是只属于定性检测方法；虽然定性PCR具有很高的灵敏度，但是它不能反映患者感染的严重程度和治疗效果，从而促进了定量PCR方法的出现和发展；荧光定量PCR技术可以真实地反映病毒感染和DNA复制量的关系，在临床上常用于抗病毒疗效的检测。

数字PCR技术是近年兴起的第三代PCR绝对定量技术，与实时荧光定量PCR技术相比，数字PCR不依赖于扩增曲线的阈值（CT）进行定量，不受扩增效率的影响，也不必采用看家基因和标准曲线，具有很好的准确度和重现性，可以实现绝对定量分析。在现阶段的低丰度因子检测中，实时荧光定量PCR技术都因受到背景DNA或杂质的干扰，使得检测灵敏度及精确性都达不到精准定量的要求，而数字PCR检测系统通过微滴化处理，使得稀有检测片段从大量的复杂背景中分离出来，从而提高检测的灵敏度和精确性。然而，目前并没有用于检测HHV6A/6B的数字PCR绝对定量分型检测试剂盒及其检测方法。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种用于检测HHV-6A/6B的数字PCR绝对定量分型检测试剂盒，其中包括有HHV-6A/6B通用引物和各自特异的检测探针。

本发明的另一目的是提供一种用于检测HHV-6A/6B的数字PCR绝对定量分型检测方法，利用上述试剂盒中两条不同的探针对HHV DNA模板进行检测，根据荧光类型和荧光微滴数HHV-6A/6B进行分型和绝对定量检测。

实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种用于检测HHV-6A/6B的数字PCR绝对定量分型检测试剂盒，包括DNA提取液、数字PCR反应缓冲液A、数字PCR反应缓冲液B、HHV-6A病毒基因阳性质控、HHV-6B病毒基因阳性质控、阴性质控和内标溶液；

所述DNA提取液包括50 mM pH 8.3的Tris-HCl、0.5 M NaCl、5 mM EDTA、质量浓度为1.5%的CTAB和2 mM的DTT；

所述数字PCR反应缓冲液A包括HHV-6A型的引物及探针和HHV-6B型的引物及探针；所述数字PCR反应缓冲液B包括内标的引物及探针；所述HHV-6A、HHV-6B和内标的引物及探针如下所示：

HHV-6A型和HHV-6B型通用上游引物：

CCGTGGGATCGTCTAAAATTATAGATGT；

HHV-6A型和HHV-6B型通用下游引物：

CCACACTAGTCCGGACGGATAA；