[发明专利]亚洲玉米螟吐丝基因片段及其克隆方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及昆虫丝腺泌丝因子的一种基因序列、氨基酸序列，具体涉及亚洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)丝素轻链蛋白基因的核苷酸序列和氨基酸序列，并涉及该基因的用途。

背景技术

亚洲玉米螟属鳞翅目，螟蛾科，杆野螟属，又称为玉米钻心虫。亚洲玉米螟是一种多食性害虫，在中国、东南亚、澳大利亚、印度、朝鲜等地区广泛分布。亚洲玉米螟食性非常广泛，寄主范围广，除玉米、高粱、谷子外，还有小麦、棉花、水稻等多达69种。亚洲玉米螟低龄幼虫会在玉米心叶中取食，致使玉米心叶不能展开，同时低龄幼虫可以吐丝下垂，借助风力转移为害；高龄幼虫会在茎杆及穗部钻蛀，使植株得不到足够的养分而使生长发育受阻，导致玉米、棉花等籽粒干瘪、灌浆不足，继而造成产量下降。有研究表明，亚洲玉米螟给世界粮食生产都造成了严重的经济损失，在中国亚洲玉米螟造成玉米减产十分严重，虫害发生严重的年份损失达到30％。近年来亚洲玉米螟的发生规律随着气候条件的改变也发生了变化，发生频率更是逐渐上升，鉴于此，我国每年都会耗费巨大的人力、物力对该虫进行防治，但效果却一直不理想。

本专利从亚洲玉米螟幼虫吐丝转移和化蛹滞育前吐大量丝的现象着手，寻找亚洲玉米螟与吐丝相关的基因，并利用RNAi技术干扰相关基因的表达乃至沉默，从而达到减轻亚洲玉米螟为害的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种亚洲玉米螟吐丝基因片段及其克隆方法和应用，本发明采用同源基因克隆策略和PCR技术，扩增中间片段，再根据测序结果，设计3’和5’引物，使用RACE法，分别扩增出3’和5’区段，测定序列后拼接成完整的基因序列，再使用ORFFinder分析得到亚洲玉米螟丝素蛋白基因轻链基因部分的开放阅读框。

本发明的第一个目的是通过以下技术方案实现的，亚洲玉米螟吐丝基因片段，序列如SEQIDNO.12所示。

本发明的第二个目的是通过以下技术方案实现的，亚洲玉米螟吐丝基因片段的克隆方法，采用同源基因克隆策略和PCR技术，扩增中间片段，再根据测序结果，设计3’和5’引物，使用RACE法，分别扩增出3’和5’区段，测定序列后拼接成完整的基因序列。

优选地，所述克隆方法包括以下步骤：

(1)亚洲玉米螟幼虫总RNA的提取；

(2)cDNA第一条链的合成；

(3)亚洲玉米螟丝素轻链基因中间片段扩增；

(4)丝素轻链基因的3’Race；

(5)丝素轻链基因的5’Race；

(6)对所得的中间片段、3’RACE片段及5’RACE片段进行拼接，得到亚洲玉米螟丝素轻链基因的cDNA全长序列。

优选地，所述亚洲玉米螟幼虫总RNA的提取参照Promega公司的SVTotalIsolationSystem试剂盒。

优选地，所述cDNA第一条链的合成步骤为：

(1)先在微型塑料离心管Microtube中按照以下比例配制10μL的反应体系：

(2)65℃保温5min后置于冰上急冷；

(3)在步骤(2)得到的反应液的体系中继续按以下比例配制反应体系：

(4)缓慢混匀，进行反转录反应，反转录反应条件：42℃60min；70℃15min；

(5)反应结束，将样品在冰上迅速冷却，得到cDNA。

优选地，所述亚洲玉米螟丝素轻链基因中间片段扩增步骤包括：

第一，引物设计与合成

引物序列为：

Fib-F：5'-ATGCTGCCCTTCGTTTTG-3'；

Fib-R：5'-CCCAAGCTGCTTCGAATT-3'；

第二，丝素轻链基因中间片段的扩增

第三，目的基因片段产物的回收与纯化

采用TaKaRa公司的AgaroseGelDNAFragmentRecoveryKitVer.2.0试剂盒，用于凝胶回收；

第四，目的基因产物的连接与转化

第五，单菌落PCR检测。

优选地，所述丝素轻链基因的3’Race包括以下步骤：

第一，反应原理与引物设计

1)3’端的获得是通过TAKARA公司的3’-FullRACE试剂盒所获得；

2)3’race引物设计与合成：

设计了4条3’端特异性引物，分别为