[发明专利]对河流弧菌O1，O6，O7，O8和O9特异的核苷酸及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及对河流弧菌O1，O6，O7，O8和O9血清型特异的核苷酸，尤其涉及对河流弧菌O1，O6，O7，O8和O9血清型O抗原基因簇中单个基因特异的核苷酸及其应用。

背景技术

河流弧菌为革兰氏阴性菌，是海洋环境的主要栖息菌之一，广泛存在于河流和出海口环境水域，也是人类与水生生物主要的细菌性病原之一，可以起鱼、虾、贝等多种养殖动物的疾病，给养殖业带来严重的经济损失。河流弧菌还可以通过各种食物导致人类严重的流行性腹泻，是弧菌属中仅次于霍乱弧菌和副溶血弧菌的致病性弧菌，被认为是一种全球性的人兽共患的新型病原菌。它的分型与鉴定是海洋菌种库建立的重要前提之一。

细菌分型与鉴定方法主要有传统的表型方法、血清学方法以及分子鉴定方法。然而，随着分子生物学的发展，传统的血清分型和鉴定方法存在着一定的问题，如血清分型这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面血清分型方法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，不同的O抗原产生的抗血清之间经常存在交叉反应。因此，建立基于分子生物学技术的血清鉴定方法成为发展方向。

河流弧菌的分子鉴定越来越受到人们的重视，成为河流弧菌菌种与株型鉴定的重要依据，不少新菌也因此产生。对弧菌而言，生化反应主要是各种酶谱的表现，属于外部形态的内容，核酸的相似性才是弧菌种的界定最根本、最直接的特征。因此，河流弧菌的分型与鉴定最有效、最直接的方式应该从核酸的研究触发，通过比较核酸（包括基因组与核酸片段）的相似性确定河流弧菌的归属。

近年来，越来越多的分子技术用于病原菌的分型、鉴定、检测及病害诊断，包括转录间隔区(ITS)序列分析、随机扩增长度多态性(RAPD)分析、核糖体DNA限制性片段长度多态性(RFLP)分析等。分子生物学方法不仅可用于河流弧菌的快速血清分型筛查，稳定的鉴定结果可以弥补表型特征鉴定方法的不足。和传统检测技术相比，这些基于多聚酶链式反应(PCR)的分子检测技术，不需要经过病原菌的分离、纯培养等过程，而且具有快速、灵敏、特异性强等优点。

聚合酶链式反应技术(Polymerase chain reaction,简称PCR技术)作为微生物检测技术目前正在得到认同和推广，该技术相对于传统的方法有高通量、检测速度快、特异性强、灵敏度高等优点，只需对样品进行简单的预增菌或增菌过程，再通过离心及裂解制备细菌DNA模板，就可以在高特异性引物介导下的PCR过程中扩增目标序列，达到检测样品中是否含有待测的致病性微生物的目的。PCR的扩增过程仅需1个半小时。这对检验检疫部门和临床检验无疑极大提高了工作速度和降低了工作成本。

不论从国内和国际的角度来看，快速、准确地鉴定出血清类型，为河流弧菌的防控提供有效技术支持是十分重要的。

发明内容

本发明的目的在于提供了本发明涉及对河流弧菌O1，O6，O7，O8和O9血清型特异的核苷酸，其特征在于所述的核苷酸具有：

SEQ ID NO:1-10所示的核苷酸中的至少一种；所述的SEQ ID NO:1-10如下：

本发明还提供了一种PCR试剂盒，包括PCR引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，所述PCR引物为如SEQ ID NO:1-10所示的核苷酸中的至少一种。所述的试剂盒，还包括如下试剂：10 mM dNTP 30μl；10×酶特异性反应缓冲液 50μl；5U/μl耐热DNA聚合酶5μl；引物混合物10μl；阳性对照品10μl；阴性对照品10μl；ddH₂O 5ml。

其中所述的PCR引物优选为所述如SEQ ID NO:1-10所示的核苷酸中的至少一种。

本发明进一步公开了对河流弧菌O1，O6，O7，O8和O9血清型特异的SEQ ID NO:1-10核苷酸在制备用于检测河流弧菌河流弧菌O1，O6，O7，O8和O9血清型的PCR试剂盒、基因芯片或微阵列方面的应用。

本发明所述河流弧菌可以取样于自来水、河流水、海水的培养物的粗提液，或是河流弧菌的纯培养物的粗提液等。

收集河流弧菌提取基因组是采用常规方法制备获得。

针对河流弧菌的PCR试剂盒，整个检测步骤包括样品预处理—扩增—电泳检测结果。引物和PCR反应体系所需要的试剂已预先加入扩增管中，使用者只需将预处理后的样本加入扩增管启动扩增反应即可，简单快速的完成检测工作。