[发明专利]一种利用Tn7转座元件整合表达外源蛋白的重组枯草芽孢杆菌构建方法

权利要求书

1.一种利用Tn7转座元件整合表达外源蛋白的重组枯草芽孢杆菌构建方法，其特征在于：是通过构建一种用于在枯草芽孢杆菌的转座整合质粒，插入外源蛋白基因及其表达元件后转化枯草芽孢杆菌，通过诱导产生Tn7转座酶TnsABCD，将外源蛋白基因及其表达元件转座整合到枯草芽孢杆菌染色体glms基因下游3’端的attTn7位点；通过变温培养，将培养温度从26-30℃提高到33-37℃，使转整合表达质粒上的温度敏感复制子失去作用，得到不再保留含有抗生素抗性基因和Tn7转座酶的转座整合质粒的重组枯草芽孢杆菌；将菌落转到不含抗生素的液体营养培养基上培养，能表达出活性蛋白质的菌株即为所需的转座整合表达外源蛋白基因的重组枯草芽孢杆菌，所述的营养培养基是常规的发酵营养培养基，包括蛋白胨或水解蛋白1～50g/L，酵母提取物1～25g/L，氯化钠1～15g/L。

2.根据权利要求1所述的一种利用Tn7转座元件整合表达外源蛋白的重组枯草芽孢杆菌构建方法，其特征在于：利用Tn7转座元件将外源蛋白基因及其表达元件转座整合到枯草芽孢杆菌，该方法的步骤为：构建一种用于枯草芽孢杆菌的转座整合质粒，插入外源蛋白基因及其表达元件后转化枯草芽孢杆菌，通过诱导产生Tn7转座酶TnsABCD，将外源蛋白基因及其表达元件转座整合到枯草芽孢杆菌染色体glms基因下游3’端的attTn7位点；所述Tn7转座酶TnsABCD是用来识别和剪切Tn7转座片段、识别attTn7转座位点和促使Tn7转座片段插入到该位点。上述的Tn7转座酶TnsABCD可以用阿拉伯糖操纵子，包括抑制子araC和启动子Pbad来诱导表达，或用乳糖操纵子，包括阻遏基因lacI，操纵基因lacO和启动子lacP来诱导表达；

所述用于枯草芽孢杆菌的转座整合质粒，包含有下列组分：能在大肠杆菌中复制质粒的复制子和能在枯草芽孢杆菌中复制质粒的温敏复制子，含有抗生素抗性基因、转座子Tn7左右臂盒子、多克隆位点、Tn7转座酶TnsABCD片段及其诱导表达元件；

所述能在大肠杆菌中复制质粒的复制子是pBR322ori，或colE1ori；所述可用于枯草芽孢杆菌中复制质粒的温敏复制子是pWV01ori/ts，其特点是在28℃左右可以行使复制功能，但在35℃左右时失去复制能力；

所述可在枯草芽孢杆菌中使用的抗生素抗性基因是氯霉素抗性基因、新霉素抗性基因、红霉素抗性基因或壮观霉素抗性基因，该抗生素抗性基因克隆于Tn7左臂和右臂之外，在转座重组时不会被转座整合到枯草芽孢杆菌染色体上；

所述的用于枯草芽孢杆菌转座整合表达的外源蛋白基因，是酶、抗菌肽活性蛋白质基因；所述的外源蛋白基因的表达元件，包括以下组分：能在枯草芽孢杆菌中高效转录的启动子如P43启动子，或Pamy启动子；高效分泌的信号肽片段如sacB信号肽片段，或amyQ信号肽片段；所述的外源蛋白基因及其表达元件克隆于Tn7左臂和右臂之间的多克隆位点；

所述的用于转座整合的枯草芽孢杆菌宿主为枯草芽孢杆菌168衍生菌株如1A751，WB600，WB800。