[发明专利]一种评价转基因抗虫水稻水生环境安全性的方法

权利要求书

1.一种评价转基因抗虫水稻水生环境安全性的方法，其特征在于，包括如下过程：

（1）转基因稻田和非转基因稻田布置和管理；

（2）稻田水层和淤泥中外源蛋白的测定；

（3）稻田水层中浮游生物的分离；

（4）稻田水层中浮游生物种类和丰度的测定；

（5）转基因抗虫水稻的种植对浮游生物的安全性评价；

以上所述转基因稻田和非转基因稻田布置和管理包括如下步骤：

1）选择地势平整、水源方便的田块3至5块，田块面积400-600m²，长宽比范围2∶1至1∶1，田周边及水源无生活污水污染；

2）将步骤1）中的田块划分成小区，田块周围筑不透水田埂及硬化沟渠；为防止暴雨漫灌，田块周边建立良好排水沟；

3）在步骤2）中的上游小区种植转基因抗虫水稻，下游小区种植非转基因水稻，中间两块非转基因小区用上游转基因小区的田水灌溉，两侧的两块小区直接用水源中的水灌溉；

4）从移栽至成熟期，不施用化学农药，人工除草，中期不晒田。

2.根据权利要求1所述的评价转基因抗虫水稻水生环境安全性的方法，其特征在于，所述田块划分成小区的具体方案为：靠近水源的上游小区并列设置两块转基因小区，位于转基因小区下游的下游小区并列设置4块非转基因小区；所述两块转基因小区的上游与水源之间分别设立连通沟渠、下游分别与中间的两块非转基因小区通过沟渠连通；所述非转基因小区的外侧两块分别通过沟渠与所述水源连通；所述4块非转基因小区分别设置排水沟渠。

3.根据权利要求1所述的评价转基因抗虫水稻水生环境安全性的方法，其特征在于，所述稻田水层和淤泥中外源蛋白的测定，包括样本的预处理和外源蛋白的抽提与通过酶联免疫吸附法测定，具体包括如下步骤：

1）水样采集及预处理：水样采集小区包括所有转基因小区和非转基因小区，用10ml离心管进行田间水样采集，各小区分别取5管，取上层清水，拿回室内，将每份样品转到新的10ml离心管中，然后进行冷冻，冷冻后封上封口膜，用针头在膜上扎孔，然后放入冷冻干燥机进行浓缩至干；将干燥后的样品放入4℃低温保存，24小时内待测；

2）淤泥样品采集及预处理：土样采集小区包括所有转基因小区和非转基因小区，各拔5蔸水稻取根围淤泥，装入50ml离心管，带回室内放入-20℃冰箱冷冻，然后放入冷冻干燥机进行浓缩至干，将干燥后的淤泥碾碎，过80目筛除去根毛，准确称取每份样品0.5g，转入到1.5ml离心管中，放入4℃低温保存，24小时内待测；

3）外源蛋白抽提缓冲液配制：取250ml锥形瓶分别加入：100 mM Na₂CO₃，100 mM NaCl，5 mM 乙二胺四乙酸，10 mM二硫苏糖醇，50 mM Na₄P₂O₇·10H₂O，1% (v/v) 聚乙二醇辛基苯基醚，pH 值为10，即为抽提缓冲液；

4）外源蛋白的抽提与测定：分别将步骤1）与2）中的样品加入到外源蛋白抽提缓冲液中进行抽提，再用酶联免疫吸附试剂盒进行外源蛋白的测定。

4.根据权利要求1所述的评价转基因抗虫水稻水生环境安全性的方法，其特征在于，所述稻田水层中浮游生物的分离，包括水样采集、游生物的沉淀分离，具体包括如下步骤：

1）确定调查时间：调查时间分别选在水稻的分蘖期、拔节期、孕穗期、开花期及乳熟期；

2）水样采集及浮游生物的沉淀分离：采用5点取样法对所有转基因小区和非转基因小区分别选取5个点，每个点用带柄量杯采田水10L，装入桶后，先用25目过滤漏勺滤去水稻凋落物和其它大块杂物，再用23#生物网过滤，将过滤网内的剩余物移入1L浮游生物沉淀器，用水定容至1L，沉淀4小时；将沉淀后的水样用虹吸方法将上层清液转至1L容量瓶，虹吸时，注意将虹吸管的一端放在液面稍下一点，控制流速，缓缓虹吸，以防吸出沉淀器底部的颗粒沉淀物，再次定容至1L，制成含浮游生物水样，待测。