[发明专利]一种增强间充质干细胞分泌生物活性因子能力及培养液中活性因子的提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于增强动物间充质干细胞分泌生物活性因子能力的方法，以及涉及一种提取间充质干细胞培养液中生物活性因子的技术方法。

背景技术

间充质干细胞源于动物胚胎发育早期的中胚层和外胚层。间充质干细胞是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，属于非终末分化细胞，它既有间质细胞，又有内皮细胞及上皮细胞的特征。间充质干细胞有体外贴壁生长的特性，利用这种特性，人们已经从骨髓、脂肪、外周血、胎盘、脐带等多种组织中成功将其分离培养出来，这些组织成为间充质干细胞实验研究和临床应用的重要来源。

间充质干细胞在体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、软骨、骨、肌肉、肌腱、神经、肝、心肌、胰岛β细胞和内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能。不论是自体还是同种异源的间充质干细胞，一般都不会引起宿主的免疫反应。

间充质干细胞具有多分化潜能，可产生多种生长因子、细胞因子、调节肽以及干细胞特异性归巢和营养因子等生物活性因子的细胞体系，所分泌的上述物质在局部形成复杂的生物活性因子网络，并受缺血、缺氧、生长因子、性别和激素调节。

现已证实，干细胞能表达、合成并分泌生长因子、细胞因子、调节肽及信号分子等多种生物活性因子，而且胚胎干细胞和成体干细胞以及不同来源的成体干细胞所产生的生物活性因子谱相似，这些生物活性因子调节代谢、免疫、细胞分化、增殖、迁移、营养、存活、凋亡和组织器官功能。这些研究结果提示干细胞是机体潜在的旁分泌/自分泌系统，植入后干细胞的分泌功能不仅直接影响植入干细胞自身的存活和分化，而且是干细胞移植发挥治疗效应的重要机制之一。

干细胞所分泌的生物活性物质在局部形成复杂的生物活性因子网络，并受缺血、缺氧、生长因子、性别和激素调节。其分泌功能影响移植干细胞自身及所在组织器官的结构、功能及其病理状态下的修复，是干细胞改善靶器官功能、抗凋亡、抗炎等疗效的重要机制之一。

体内各组织中的氧浓度存在较大差别，且生理、病理状态下均处于低氧环境，间充质干细胞移植后也将处于低氧微环境。然而，目前间充质干细胞在体外细胞培养时大多在常氧环境下进行，与体内正常组织低氧环境及病理状态下低氧状态相差较大.低氧环境对间充质干细胞生物学特性的影响也有一些研究进展。适度的低氧能够促进细胞增殖、迁移，抑制凋亡，影响细胞分化。

公开号为CN101461772A的发明专利提供了一种用于美容护肤的人干细胞分泌因子的制 备方法。但是该专利方法所用的培养液含有胎牛血清成分。利用其技术提取的干细胞分泌生物活性因子量较少，且存在血清的安全隐患，因此应用上局限性较大，仅适用于美容护肤方面的应用，对于更深一步的医学治疗不适用。

发明内容

鉴于以上方法的缺点，本发明采取了较安全的无血清培养液对拟提取生物活性因子的干细胞进行培养，并且增强了间充质干细胞在体外培养过程中分泌生物活性因子的能力。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：制备原代动物间充质干细胞——无血清低氧培养、扩增——收集废弃间充质干细胞培养液——生物活性因子提取、浓缩、灭菌——高纯度干细胞生物活性因子提取液。

本发明选用无血清培养液培养间充质干细胞。

优选地，选用Invitrogen公司STEMPRO MSC SFM培养液培养间充质干细胞。

本发明采用低氧培养技术增加间充质干细胞分泌生物活性因子的能力。

优选地，低氧培养间充质干细胞所选用的氧气浓度为1％～2％。

本发明定期对培养的间充质干细胞的无血清培养液进行更换。

优选地，间充质干细胞每培养3-4天对培养液进行半量更换，并收集废弃培养液。

本发明对收集到的间充质干细胞废弃培养液进行生物活性因子的超滤和浓缩。

优选地，选用50KD中空纤维超滤柱进行超滤浓缩。

本发明对浓缩后的间充质干细胞生物活性因子提取液进行过滤除菌。

优选地，选用孔径为0.22μm的滤膜进行过滤除菌。

本发明的有益效果是：

1.对间充质干细胞的培养使用无血清培养液，避免了血清源性污染。

2.使用不含动物源性成分的无血清培养液培养间充质干细胞，所提取到的生物活性因子在应用上不受血清等动物源性成分的应用限制。

3.采用低氧培养技术，特异性地增加间充质干细胞分泌生物活性因子的能力，降低传统方法生产间充质干细胞生物活性因子的成本。

4.通过超滤除菌等步骤，保证了间充质干细胞生物活性因子提取物的安全性。