[发明专利]一种李辐射变异材料的早期鉴定方法

说明书

本发明涉及一种辐射育种材料早期鉴定的方法，属于育种鉴定技术领域，所述的方法包括叶片采集、李叶片基因组DNA提取与检测、PCR反应体系、ISSR引物筛选、李辐射诱变材料的ISSR分析、凝胶图像分析。在辐射育种过程中，仅有部分材料发生了变异。果树生长周期较长，采用传统的植物学特征形态鉴定法和花粉显微电镜扫描法等方法进行变异材料的鉴定较为困难。本发明提供的方法可以对李辐射诱变材料进行早期鉴定，操作方便，简单易行。

技术领域

本发明属于育种鉴定技术领域，具体涉及一种辐射育种材料早期鉴定的方法。

背景技术

辐射诱变育种是指人为地利用一定剂量的物理射线照射植物材料诱发使其变异，并经过人工选择、鉴定、培育新的品种。辐射诱变是培育果树新种质和新品种的有效途径。果树辐射诱变育种可以提高果树基因突变频率，缩短育种年限，可以在短期内获得常规育种难以获得的新种质。然而，在辐射育种过程中，仅有部分材料发生了变异。果树生长周期较长，采用传统的植物学特征形态鉴定法和花粉显微电镜扫描法等方法进行变异材料的鉴定较为困难。分子标记技术以其快速、高效、中性的特点在育种材料早期选择等方面日益显示出重要作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种进行李辐射诱变材料早期鉴定的方法，加快李育种进程，降低育种成本。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

1.叶片采集：采集李母树和辐射诱变植株的嫩叶。

2.李叶片基因组DNA提取与检测：采用传统CTAB法或植物基因组DNA提取试剂盒进行李叶片基因组DNA的提取。取5μL DNA 溶液用1%的琼脂糖凝胶电泳进行DNA纯度检测，电泳缓冲液为1×TAE Buffer，电泳20min后，凝胶用核酸染料进行染色，并用凝胶成像系统仪进行凝胶图像采集。最后将各材料的DNA浓度稀释至40ng/μL备用。

3.PCR反应体系：PCR mix 10 μL，引物0.8μL，模板1μL，水8.2μL，总体积为20μL。PCR反应程序为程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；最后72℃延伸10 min。

4.ISSR引物筛选：以部分材料的基因组DNA为模板，进行ISSＲ适宜引物筛选。

5.李辐射诱变材料的ISSR分析：以筛选出的引物进行李辐射诱变材料DNA的ISSR-PCR扩增。PCR扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳进行分离，电泳缓冲液为1×TAE Buffer，电泳30min后，凝胶用核酸染料进行染色，并用凝胶成像系统仪进行凝胶图像采集。

6.凝胶图像分析：将辐射诱变李材料DNA扩增产物的电泳条带，与母树的条带逐一进行比对。

本发明的优点在于：本发明提供的方法可以对李辐射诱变材料进行早期鉴定，操作方便，简单易行,成本低廉。无需通过长时间的表型观察，仅需取少量辐射诱变植株的叶片，即可在早期将未发生的材料剔除，节约育种成本。

附图说明

图1 三月李及其突变体果实。其中A、B、C为三月李果实；D、E、F为突变体果实。黑色粗线长度为1cm。

图2 ISSR引物筛选电泳图谱，1 -22分别代表引物UBC811、UBC815、UBC816、UBC821、UBC823、UBC825、UBC826、UBC827、UBC829、UBC836、UBC841、UBC842、UBC846、UBC847、UBC848、UBC850、UBC853、UBC854、UBC855、UBC856、UBC857、UBC860的扩增产物。

图3 三月李ISSR-PCR电泳图谱，1：三月李；2：红肉迟熟突变单株；3-7代表5个表型未发生显著变异的辐射诱变的三月李材料。箭头表示存在差异的条带。

具体实施方式