[发明专利]对变形杆菌O47，O21，O32和O23特异的核苷酸及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及对变形杆菌O47，O21，O32和O23血清型特异的核苷酸，尤其涉及对变形杆菌O47，O21，O32和O23血清型O抗原基因簇中单个基因特异的核苷酸及其应用。

背景技术

变形杆菌属于革兰氏阴性细菌，广泛存在于水、土壤腐败的有机物以及人和动物的肠道中，对分解有机物和动物蛋白起着重要的作用，在有氧或特许条件的厌氧环境中都具有蛋白水解酶的活性。变形杆菌为条件致病菌，多引起继发性感染，如慢性中耳炎、创伤感染等，也可引起膀胱炎、婴儿腹泻、食物中毒等。

细菌分型与鉴定方法主要有传统的表型方法、血清学方法以及分子鉴定方法。然而，随着分子生物学的发展，传统的血清分型和鉴定方法存在着一定的问题，如血清分型这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面血清分型方法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，不同的O抗原产生的抗血清之间经常存在交叉反应。因此，建立基于分子生物学技术的血清鉴定方法成为发展方向。

变形杆菌的分子鉴定越来越受到人们的重视，成为变形杆菌菌种与株型鉴定的重要依据，不少新菌也因此产生。对杆菌而言，生化反应主要是各种酶谱的表现，属于外部形态的内容，核酸的相似性才是杆菌种的界定最根本、最直接的特征。因此，变形杆菌的分型与鉴定最有效、最直接的方式应该从核酸的研究触发，通过比较核酸（包括基因组与核酸片段）的相似性确定变形杆菌的归属。

近年来，越来越多的分子技术用于病原菌的分型、鉴定、检测及病害诊断，包括转录间隔区(ITS)序列分析、随机扩增长度多态性(RAPD)分析、核糖体DNA限制性片段长度多态性(RFLP)分析等。分子生物学方法不仅可用于变形杆菌的快速血清分型筛查，稳定的鉴定结果可以弥补表型特征鉴定方法的不足。和传统检测技术相比，这些基于多聚酶链式反应(PCR)的分子检测技术，不需要经过病原菌的分离、纯培养等过程，而且具有快速、灵敏、特异性强等优点。

聚合酶链式反应技术(Polymerasechainreaction,简称PCR技术)作为微生物检测技术目前正在得到认同和推广，该技术相对于传统的方法有高通量、检测速度快、特异性强、灵敏度高等优点，只需对样品进行简单的预增菌或增菌过程，再通过离心及裂解制备细菌DNA模板，就可以在高特异性引物介导下的PCR过程中扩增目标序列，达到检测样品中是否含有待测的致病性微生物的目的。PCR的扩增过程仅需1个半小时。这对检验检疫部门和临床检验无疑极大提高了工作速度和降低了工作成本。

不论从国内和国际的角度来看，快速、准确地鉴定出血清类型，为变形杆菌的防控提供有效技术支持是十分重要的。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种对变形杆菌O抗原特异的核苷酸，其特征在于所述的核苷酸为：SEQIDNO:1-8所示的核苷酸中的至少一种：

本发明还提供了一种PCR试剂盒，包括PCR引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，所述PCR引物为如SEQIDNO:1-8所示的核苷酸中的至少一种。所述的试剂盒，还包括如下试剂：10mMdNTP30μl；10×酶特异性反应缓冲液50μl；5U/μl耐热DNA聚合酶5μl；引物混合物10μl；阳性对照品10μl；阴性对照品10μl；ddH₂O5ml。

其中所述的PCR引物优选为所述如SEQIDNO:1-8所示的核苷酸中的至少一种。

本发明进一步公开了一种对变形杆菌O抗原特异的SEQIDNO:1-8核苷酸在制备用于检测变形杆菌O抗原PCR试剂盒、基因芯片或微阵列方面的应用。

本发明所述变形杆菌可以取样于土壤、水、垃圾、腐败有机物的粗提液，或是变形杆菌的纯培养物的粗提液等。

收集变形杆菌提取基因组是采用常规方法制备获得。

针对变形杆菌的PCR试剂盒，整个检测步骤包括样品预处理—扩增—电泳检测结果。引物和PCR反应体系所需要的试剂已预先加入扩增管中，使用者只需将预处理后的样本加入扩增管启动扩增反应即可，简单快速的完成检测工作。

本发明还提供一种液相检测芯片，包括液相磁珠和连接在液相磁珠上的寡核苷酸探针，以及相应探针所在片段所对应的相应引物；其中所述核苷酸优选为如SEQIDNO:1-8所示的核苷酸。

本发明还提供一种微列阵，其包括上述的核苷酸；其中所述核苷酸优选为如SEQIDNO:1-8所示的核苷酸。