[发明专利]具有染料降解活性的齿毛菌漆酶及其制备方法

权利要求书

1.齿毛菌漆酶的制备方法，包括以下步骤：

1)用液体培养基培养齿毛菌得到发酵液，收集发酵液，得到粗酶液；

2)从所述粗酶液中分离纯化漆酶，得到齿毛菌漆酶。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述齿毛菌为一色齿毛菌。

3.据权利要求2述的制备方法，其特征在于：所述一色齿毛菌的株号为GSM-01，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCCNo.7713。

4.根据权利要求1、2或3所述的制备方法，其特征在于：从所述粗酶液中分离纯化漆酶包括如下步骤：

a)将所述粗酶液进行阴离子交换柱层析，收集具有漆酶活性的洗脱峰；所述阴离子交换柱层析中所采用的阴离子交换基团是DEAE，所述具有漆酶活性的洗脱峰是如下分步洗脱中第三步洗脱得到的洗脱峰：用pH值为6.8-7.5或7.2的Tris-HCl缓冲液进行第一步洗脱，用0.05MTris-HCl-NaCl缓冲液进行第二步洗脱，用0.3MTris-HCl-NaCl缓冲液进行第三步洗脱，收集所述第三步洗脱得到的洗脱峰，得到具有漆酶活性的洗脱峰；所述0.05MTris-HCl-NaCl缓冲液和0.3MTris-HCl-NaCl缓冲液的溶质均为NaCl，溶剂均为所述Tris-HCl缓冲液；所述0.05MTris-HCl-NaCl缓冲液中NaCl的含量为0.05M；所述0.3MTris-HCl-NaCl缓冲液中NaCl的含量为0.3M；

所述Tris-HCl缓冲液中，Tris碱的含量为0.01M；

b)将从步骤a)获得的所述洗脱峰进行阳离子交换柱层析，收集具有漆酶活性的洗脱峰；所述阳离子交换柱层析中所采用的阳离子交换基团是SP，所述具有漆酶活性的洗脱峰是用乙酸-乙酸钠缓冲溶液洗脱得到的洗脱峰，所述乙酸-乙酸钠缓冲溶液的pH值为3.5-4.0或3.8，所述乙酸-乙酸钠缓冲溶液的溶质是乙酸和乙酸钠，溶剂是水，所述乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，乙酸钠的含量为0.01M；

c)将从步骤b)获得的所述洗脱峰进行阴离子交换柱层析，收集具有漆酶活性的洗脱峰；所述阴离子交换柱层析中所采用的阴离子交换基团是Q；所述具有漆酶活性的洗脱峰是如下分步洗脱中第二步洗脱得到的洗脱峰：用所述Tris-HCl缓冲液进行第一步洗脱，用0.35MTris-HCl-NaCl缓冲液进行第二步洗脱，收集所述第二步洗脱得到的洗脱峰，得到具有漆酶活性的洗脱峰；所述0.35MTris-HCl-NaCl缓冲液的溶质为NaCl，溶剂为所述Tris-HCl缓冲液，所述NaCl在所述0.35MTris-HCl-NaCl缓冲液中的含量为0.35M；

d)将从步骤c)获得的所述洗脱峰进行凝胶过滤层析，得到具有漆酶活性的洗脱峰；所述凝胶过滤层析所用的层析介质的分离范围包括3-70KD。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤a)中的阴离子交换柱层析的载体为Cellulose，所述步骤b)中的阳离子交换柱层析的载体为Sepharose，所述步骤c)中的阴离子交换柱层析的载体为Sepharose，所述步骤d)中凝胶过滤层析的介质为Superdex75。

6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于：所述步骤d)中的具有漆酶活性的洗脱峰是用如下溶液洗脱得到的：pH值为8.5的0.15M的NH₄HCO₃水溶液。

7.根据权利要求4-6中任一所述的制备方法，其特征在于：所述步骤d)所用的层析柱的柱长度和柱内径比为30:1。

8.由权利要求1-7中任一所述的制备方法得到的齿毛菌漆酶。

9.根据权利要求8所述的齿毛菌漆酶，其特征在于：齿毛菌漆酶具有下述至少一种特性：

1)分子量为63.2kD；

2)在37℃、pH4.5对2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐酶活性为2.05×10⁴U/mg；

3)在25℃pH3.0对2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐的K_m值是0.303mM；

4)最适温度为45℃；

5)最适pH为2.6。

10.权利要求8或9所述的齿毛菌漆酶的下述1)或2)的应用：

1)权利要求8或9所述的齿毛菌漆酶在制备降解染料产品中的应用；

2)权利要求8或9所述的齿毛菌漆酶在降解染料中的应用；

所述染料为溴百里酚蓝、依文思蓝、甲基橙和孔雀石绿中的至少一种。