[发明专利]一种玉米秸秆发酵制备L-苹果酸以及米根霉菌突变株-2的选育方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及农作物秸秆的综合利用，确切地说是玉米秸秆发酵制备L-苹果酸以及发酵菌株米根霉菌突变株-2的选育方法。

二、背景技术

苹果酸化学名称为2-羟基-1.4-丁二酸，由于连接羟基的碳原子为不对称碳原子，导致在旋光性上表现为右旋(D-)、左旋(L-)和外消旋(DL-)。因为苹果酸的手性结构，故常以三种形式存在，包括D-苹果酸、L-苹果酸、DL-苹果酸。在果实中最常见的是L型，呈现白色结晶或粉末，有特殊的酸味。

L-苹果酸是一种重要的有机酸，广泛运用于食品和化学等领域。与柠檬酸相比，苹果酸酸度大、产热低，味道柔和、持久且具特殊香味，被誉为“最理想的食品酸味剂”。

传统的L-苹果酸发酵是以葡萄糖或者淀粉类为原料，若能利用农作物水解液发酵产L-苹果酸，将扩大原料来源，有效降低成本。在我国生物质纤维素原料丰富，但利用率低，一般采取焚烧填埋等方式处理，不仅浪费资源也对生态环境造成了破坏。有关利用生物质纤维素生产生物乙醇、生物柴油等研究报道很多，但利用生物质纤维素生产有机酸尤其是L-苹果酸的报道较少。如何利用玉米秸秆水解液发酵产L-苹果酸具有深远的意义。

自然界中产L-苹果酸的菌有米根霉、黄曲霉、寄生曲霉、华根霉等，其中米根霉产L-苹果酸具有营养要求简单、好氧发酵、产物纯度高等特点而被广泛使用。对于微生物菌株进行诱变处理可在短时间内筛选出合适的菌株，积累对人类有益的某一种或几种代谢产物，同时减少副产物的生成，最终将筛选得到的高产、优质菌种推广应用，目前所运用的诱变方法主要包括紫外照射诱变，电离辐射诱变，离子注入诱变，航天育种，复合诱变等。

⁶⁰Co属于电离辐射诱变，因其具有高能量，可以通过电离作用直接或间接改变DNA结构，从而达到诱变目的。利用⁶⁰Co辐射结合丙烯醇平板筛选乙醇脱氢酶缺陷型菌株，阻断了乙醇代谢，降低副产物乙醇生成。利用⁶⁰Co辐射结合氟乙酸平板筛选乙醛酸循环缺陷型菌株，降低了副产物富马酸及琥珀酸的产量。

在目前的L-苹果酸生产过程中，多以葡萄糖、淀粉等作为发酵碳源，原料成本高。发酵过程中伴随乙醇、富马酸、琥珀酸等副产物的生成，且采用分批发酵，发酵周期长，连续性弱。

三、发明内容

本发明的目的在于利用玉米秸秆制备L-苹果酸，所要解决的技术问题利用生物发酵的方法以及选育一株产量高且副产物少的米根霉菌优良的突变菌株。

本发明利用玉米秸秆发酵制备L-苹果酸的方法，包括液体培养基的配制、灭菌、接种、发酵培养和分离，与现有技术的区别是所述的液体培养基是以浓度为85-115g/L的玉米秸秆水解液作为培养基的基材，也作为碳源，同时添加氮源、无机盐和中和剂，具体为在1L水解液中添加硫酸铵3.5～4.5g/L、硫酸镁0.25～0.35g/L、硫酸亚铁0.020～0.030g/L、磷酸二氢钾0.45～0.55g/L、硫酸锌0.05～0.15g/L、碳酸钙70～90g/L；培养基灭菌后接种米根霉菌突变株-2，孢子浓度为10⁶～10⁸CFU/mL、接种量为发酵液的8～12vt％(体积百分比，下同)，所述的发酵培养是在发酵罐中于31～33℃、通气量(空气)0.35～0.45L/L·min条件下搅拌发酵70～75小时，发酵后固液分离；发酵液采用碱性离子交换树脂D301进行吸附分离，pH为3～4，温度20～30℃，水洗脱，得L-苹果酸水溶液，对其进行定性分析，结果如图2所示。

优选液体培养基浓度：玉米秸秆水解液100g/L，硫酸铵0.40g/L，硫酸镁0.30g/L，硫酸亚铁0.025g/L，磷酸二氢钾0.50g/L，硫酸锌0.10g/L，碳酸钙80g/L。

优选孢子浓度10⁷CFU/mL，接种量10vt％(体积百分比)。

所述的玉米秸秆水解液是玉米秸秆粉碎过40目筛，加入1～2倍量(以质量计，下同)的水于球磨机中湿球磨1～2h；然后转入水解釜中，再加5～6倍量的水，并用硫酸溶液调pH值2～3，于110～130℃搅拌水解1～1.5小时，水解后用氨水调pH值4.5～5.5，固液分离；滤液浓缩至浓度85～115g/L，即是玉米秸秆水解液。

所述的米根霉菌突变菌株是这样选育的：

1.利用同位素⁶⁰Co对出发菌株米根霉菌(Rhizopus oryzae CICC41160)进行诱变，诱变剂量10～30Gy，辐照时间为20min。