[发明专利]一种制备葡萄溃疡病菌分生孢子的方法

说明书

本发明公开了一种制备葡萄溃疡病菌分生孢子的方法。该方法包括：1)将葡萄溃疡病菌接种到PDA培养基上，培养至菌落生长旺盛；2)选取对葡萄溃疡病菌敏感的葡萄品种，将健康的葡萄绿枝条剪成30cm，表面消毒；3)在绿枝条上打孔，去掉韧皮部；菌落用灭菌的打孔器制备菌丝块，将制备好的菌丝块接种于打孔处，用薄膜包裹菌丝块保湿，并将接种过的枝条插入装有无菌水的组培瓶内，于28℃培养；相对湿度大于90％的条件培养48小时，然后湿度维持在70％培养5‑10天。本发明可缩短分生孢子制备时间，制备的孢子悬浮液孢子差异小，质量稳定、致病力强，为葡萄溃疡病菌的致病性测定、群体遗传分化和致病机理解析等提供了保证。

技术领域

本发明涉及一种制备葡萄溃疡病菌分生孢子的方法。

背景技术

由葡萄座腔菌科真菌引起的葡萄溃疡病近年来在我国的葡萄主产区均有发生，病原菌侵染葡萄的果实、枝干等部位引起葡萄果梗干枯、枝干溃疡等症状，造成树势减弱甚至整株死亡，给葡萄生产带来了不同程度的损失(Ji-Ye Yan，Yue Xie，Wei Zhang.，etal.Species of Botryosphaeriaceae involved in grapevine dieback inChina.Fungal Diversity，2013，61(1)：221-236.)。在我国4种葡萄座腔菌科真菌能够引起葡萄溃疡病，其中Lasiodiplodia theobromae是其中的优势种且致病力较强，其制备的孢子悬浮液是种类鉴定、致病性测定和侵染机理研究的前提(Yan J Y，Li X H.Occurrenceof grapevine trunk disease caused by Botryosphaeria rhodina in China.PlantDisease，2011，95(2)：219.)。试验中由于在同一培养基上不断的用菌丝频繁的转接，Lasiodiplodia theobromae菌株出现产孢量降低、致病力退化等问题，给后续致病性测定、致病机理研究等带来了困难。因此，如何建立一种快速、高效的大量获取分生孢子及制备孢子悬浮液的方法是一个亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备葡萄溃疡病菌(Lasiodiplodia theobromae)分生孢子的方法，该方法可提高葡萄溃疡病菌(Lasiodiplodia theobromae)分生孢子产量，以快速、有效的制备孢子悬浮液。

本发明的方法通过优化诱导产孢条件及制备孢子悬浮液的过程以快速获得数量大、致病力强的孢子悬浮液。

基于上述发明目的，本发明的制备葡萄溃疡病菌(Lasiodiplodia theobromae)分生孢子的方法，包括以下步骤：

1)将葡萄溃疡病菌接种到PDA培养基上，在每天11-13小时光照的条件下，于25-28℃培养箱中培养至菌落生长旺盛；

2)选取对葡萄溃疡病菌敏感的葡萄品种作为接种材料，将健康的葡萄绿枝条剪成28-32cm，先表面消毒，再用无菌水冲洗，于灭菌的滤纸上晾干；

3)用灭菌的打孔器在步骤2)中处理的绿枝条上打孔，去掉韧皮部；将步骤1)培养获得的菌落用灭菌的打孔器制备菌丝块，将制备好的菌丝块接种于打孔处，用封口膜包裹菌丝块保湿，并将接种过的枝条插入装有无菌水的组培瓶内，于28-30℃、每天11-13小时光照的条件下培养；其中，在相对湿度大于90％的条件下培养36-48小时，然后湿度维持在70-80％，培养5-10天。

上述方法中，所述对葡萄溃疡病菌敏感的葡萄品种为夏黑品种葡萄。

上述方法中，步骤1)中，所述菌落生长旺盛为菌落直径生长至整个培养皿直径的7/9-8/9；优选的，所述菌落生长旺盛为用9cm的培养皿培养菌株，菌落生长直径为7-8cm。一般的，培养时间为2-4天，具体可以为3天。

上述方法中，步骤1)中，所述的光照条件优选在每天12小时光照12小时黑暗的条件。