[发明专利]一种提高哺乳动物体细胞克隆技术效率的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地说，本发明涉及一种提高哺乳动物体细胞克隆技术效率的方法。

背景技术

动物体细胞克隆的基本前提是单个细胞具有全能性作为供体，移入成熟的除去遗传物质的卵母细胞中，激活后在体外发育成克隆胚胎并移植到受体动物体内，经妊娠后生产出遗传信息相同的克隆动物。动物体细胞克隆技术的成功对生命科学的发展具有重要的推动作用，不仅证明了动物的体细胞具有全能性，而且有巨大的应用前景。随着近几年来的不断发展，体细胞克隆技术为研究胚胎发育过程中细胞分化的机理、基因组印记、细胞核质关系等提供了新的手段。在家畜育种、生物制药、濒危动物保护等领域也展示出了巨大的应用前景。

然而在生产实践中克隆的成功率很低，在多莉的研究试验中发现，克隆的成功率只有0.36％，动物体细胞克隆的公认成功率为1％～3％。而猪的克隆效率远远低于其他动物，这是由于猪胚胎的特殊生理所决定，总克隆效率低于0.5％。要想在近期提高猪体细胞克隆效率的难度非常大，也不是近期能马上解决的问题。

由于猪体细胞克隆技术市场需求大，且也具备大量克隆条件，可以进行工厂化和商业化大规模生产。然而现有的猪体细胞克隆技术难以满足工业化大规模生产的要求，大规模制备克隆猪，则需要大量制备克隆胚胎，而胚胎操作效率低，要求数量大，且操作步骤繁琐，不便于工业化生产。

现在猪体细胞克隆技术常规操作流程包括：供体体细胞的培养与筛选；受体卵母细胞的收集、体外成熟；去核(从受体卵母细胞移除遗传物质)；将处理的供体体细胞移入去核的卵母细胞内构建重构胚；重构胚的人工激活、培养以及重构胚的移植。其中移核要求从去核留下的透明带上的狭缝将供体细胞(核和带有的细胞碎片)注入去核的卵母细胞周隙中并向卵母细胞膜方向压紧(如图1所示)，这就要求技术员对每一枚胚胎进行不同的两次操作，且技术员必须同时掌握去核和移核两种操作手法。

发明内容

基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种提高哺乳动物体细胞克隆技术效率的方法，以达到优化哺乳动物体细胞克隆技术显微操作过程，提高操作效率，缩短显微操作人员技术培训时间，从而解决上述背景技术中的不足。

为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

一种提高哺乳动物体细胞克隆效率的方法，包括以下步骤：

(1)、按常规方法将哺乳动物卵母细胞在体外成熟培养，在体视显微镜下挑选第一极体排出、细胞膜完整、圆形、卵周隙可见的卵母细胞；

(2)、在超净台内，选择培养皿中细胞汇合率60％-80％，用0.1％胶原酶进行消化，用操作液离心洗涤，调整至10⁶/ml的细胞密度，作为供体细胞，放置于热台备用；所述操作液的配方为：9.5g/LTCM-199、0.05g/LNaHCO₃、0.75g/LHepes、0.05g/L青霉素、0.06g/L链霉素、1.755g/LNaCl、3g/L牛血清白蛋白；

(3)、40倍目镜镜下，在去核操作盘操作滴中放入步骤(1)的卵母细胞，调整使持定针高度略高于卵母细胞，吸取一个卵母细胞后，用注射针调整卵母细胞位置，使持定针位于9点钟方向，第一极体位于4点钟方向，调整去核针高度，使其在同一焦距下，从3点钟位置进针，针口置于卵周隙对着第一极体，回吸吸入第一极体和极体后方1/15左右的细胞质，退针吐出吸入的胞质和极体用针下拨卵母细胞，持定针吸走杂质并自动固定下一枚待操作胚胎，如此反复，直到胚胎全部完成；

(4)、将步骤(3)去核的操作盘置于另一台操作仪下，取步骤(2)处理好的供体细胞吹打混匀后用移液器移入到细胞操作滴中，将移核针调节到最佳位置，选取中等大小、活力较好的供核细胞吸入移核针中，持卵定针固定去核卵母细胞后，调节移核针至于去核卵母细胞同一平面，稍微给移核针一点向外打供核细胞的力，待供核细胞将要出针口的瞬间快速刺入去核卵母细胞卵周隙，待供核细胞进入去核卵母细胞卵周隙后迅速移出移核针，用针下拨去核卵母细胞，持定针固定下一枚待操作胚胎，如此反复，直到第一批去核的胚胎全部完成移核；

(5)、按常规方法进行融合、手术移植，即得转基因哺乳动物。

在其中一些实施例中，步骤(3)和(4)中，使用两台显微操作仪分别进行。

在其中一些实施例中，步骤(4)中，所述移核针在去核卵母细胞的任意位置刺入。

在其中一些实施例中，所述哺乳动物为猪、牛、羊、鼠、或兔。

在其中一些实施例中，所述哺乳动物为猪。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：