[发明专利]泽泻3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶抗体制备及检测方法

权利要求书

1.一种泽泻3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶，其特征在于：具有序列表SEQ ID No.2的氨基酸序列，或由具有序列表SEQ ID No.1的碱基序列的基因所编码。

2.根据权利要求1所述的泽泻3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶，是由泽泻3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶原核表达获得的纯化蛋白。

3.一种根据权利要求1所述的泽泻3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的多克隆抗体制备方法，其特征在于：原核表达纯化3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶蛋白并于用免疫家兔制备多克隆抗体。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：取纯化后的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶蛋白，采用皮下注射法免疫2-2.5 Kg的新西兰白兔，400 μg/次，2-3 周免疫一次，共免疫4次；采血检测，通过间接 ELISA 方法确定抗血清针对蛋白的效价，待效价大于 1:50, 000 进行最终采血制备抗血清，纯化得多克隆抗体，并进行Western blot检测。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的纯化是将蛋白与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，将所得抗血清与 PBS 等量混合后缓慢上样，待抗原抗体结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体，立即在PBS 中进行 4 ℃透析过夜，隔日进行纯度，浓度和效价测定。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的ELISA 方法包括以下步骤：

（1）用pH 9.6, 0.05 mol/L的碳酸盐缓冲液将纯化的抗体稀释为20 μg/mL，包被酶标板，每孔100 μL，4 ℃包被过夜；

（2）次日每孔加入100 μL 5%的脱脂奶粉，37 ℃封闭1 h后，用pH 7.4 的PBST洗涤3次；

（3）然后每孔加入500～51, 200倍稀释的兔抗血清100 μL，阴性对照为1:50倍稀释的免疫前血清，空白对照为兔抗血清稀释液(PBS)，每份样品均做1平行，37 ℃孵育1 h后，同上洗涤3次；

（4）再次每孔加入100 μL HRP标记的羊抗兔IgG，37 ℃孵育1 h后，同上洗涤3次；

（5）每孔加入100 μL TMB显色液，37 ℃避光反应20 min后，每孔再加入50 μL 2 mol/L硫酸终止液；

（6）在酶标仪上测450 nm下的OD值；

（7）通过 SDS-PAGE 电泳，考马斯亮蓝染色观察纯化抗体的纯度。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的Western blot检测方法包括以下步骤：

（1）分别取 200 mg 泽泻植物组织样品，剪碎加入适量裂解液（使用前加 PMSF），匀浆器匀浆，充分裂解；

取上清 10 μL加入等体积 2X 样品缓冲液，每个泳道上样 20 μL；

（2）上样完毕后，聚丙烯酰胺凝胶先 90V 跑完积层胶，再将电压升至 200V 直到电泳结束；

（3）电泳结束后，取下凝胶进行转膜，恒压 100V 转膜，约为 1.5 h；

（4）电转结束后，取下膜后先用 PBS 洗涤 4 次，每次 5 min；

然后置于 5%（m/V）脱脂奶粉封闭液中封闭 37 ℃，1 h；

（5）用封闭液稀释一抗，膜在一抗稀释液中 37 ℃反应 1 h；

（6）洗膜4次，每次5 min；用含 5%牛奶的封闭液稀释二抗（羊抗兔-HRP）；

膜在二抗中 37 ℃反应1 h；

（7）洗膜 ECL 显影。