[发明专利]用于七种猪病病原鉴定的基因芯片及其检测方法

权利要求书

1.用于七种猪病病原鉴定的基因芯，包括：PCR反应混合液、Taq聚合酶、PCR阳性对照、PCR阴性对照、ddH₂O、检测芯片、芯片探针的点样分布、芯片盖片、杂交液、杂交阳性对照、杂交盒，采用基因芯片微量点样技术，将待测样品探针与各种质控探针固定在经过化学修饰的基片上，形成的微阵列，其特征在于：所述微阵列包括质控探针区和待测样品探针区，其中所述质控探针区内设置下述分区：

点样位置质控分区（P1），包含至少一个点样位置质控探针:SEQIDNO.8；

杂交阳性质控分区（P2），包含至少一个杂交阳性质控探针:SEQIDNO.9；

杂交阴性质控分区（N），包含点样缓冲液；

所述待测样品探针区内设置下述至少一个待测样品探针的分区：

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌探针分区（1），

副猪嗜血杆菌探针分区（2），

猪肺炎支原体探针分区（3），

猪圆环病毒2型探针分区（4），

猪繁殖与呼吸综合征病毒探针分区（5），

猪瘟病毒探针分区（6），

猪传染性胃肠炎病毒探针分区（7）.

各个探针序列如下：

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌探针：SEQIDNO.1；

副猪嗜血杆菌探针：SEQIDNO.2；

猪肺炎支原体探针：SEQIDNO.3；

猪圆环病毒2型探针：SEQIDNO.4；

猪繁殖与呼吸综合征病毒探针：SEQIDNO.5；

猪瘟病毒探针：SEQIDNO.6；

猪传染性胃肠炎病毒探针：SEQIDNO.7。

2.根据权利要求1所述用于七种猪病病原鉴定的基因芯，其特征在于：每张所述检测芯片上包括至少一个权利要求1所述的微阵列，每个微阵列可以检测一份样品。

3.根据权利要求1所述用于七种猪病病原鉴定的基因芯，其特征在于：所述每条质控探针和待测样品探针的5′端均通过15个胸腺嘧啶核苷酸连接有一个氨基。

4.利用权利要求1所述基因芯片检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒和猪传染性胃肠炎病毒的非疾病目的的检测方法，包括如下步骤：

（1）待测样品制备：按照商品化DNA/RNA提取试剂盒使用说明书提取待测样品全基因组DNA/RNA，制备待测样品DNA/cDNA；

（2）PCR扩增：25μLPCR反应液包含:rTaq酶12.5μL、引物Mix:3.1μL、待测样品DNA/cDNA5μL、无核酸酶灭菌水4.4μL；

其中，所述引物Mix含有：

序列为SEQIDNO.10的10μmol/L猪传染性胸膜肺炎放线杆菌上游引物0.05μL,

序列为SEQIDNO.11的10μmol/L猪传染性胸膜肺炎放线杆菌下游引物0.05μL，

序列为SEQIDNO.12的10μmol/L副猪嗜血杆菌上游引物0.1μL，

序列为SEQIDNO.13的10μmol/L副猪嗜血杆菌下游引物0.1μL，

序列为SEQIDNO.14的10μmol/L猪肺炎支原体上游引物0.1μL，

序列为SEQIDNO.15的10μmol/L猪肺炎支原体下游引物0.1μL，

序列为SEQIDNO.16的10μmol/L猪圆环病毒2型上游引物0.05μL，

序列为SEQIDNO.17的10μmol/L猪圆环病毒2型下游引物0.05μL，

序列为SEQIDNO.18的10μmol/L猪繁殖与呼吸综合征病毒上游引物0.1μL，

序列为SEQIDNO.19的10μmol/L猪繁殖与呼吸综合征病毒下游引物0.1μL，

序列为SEQIDNO.20的10μmol/L猪瘟病毒上游引物0.05μL，

序列为SEQIDNO.21的10μmol/L猪瘟病毒下游引物0.05μL，

序列为SEQIDNO.22的10μmol/L猪传染性胃肠炎病毒上游引物0.1μL，

序列为SEQIDNO.23的10μmol/L猪传染性胃肠炎病毒下游引物0.1μL

序列为SEQIDNO.24的20μmol/L通用引物上游引物1μL，

序列为SEQIDNO.25的20μmol/L通用引物下游引物1μL.

按如下步骤进行扩增:94℃5min；94℃30sec，56℃30sec，72℃25sec循环12次；94℃30sec，50℃30sec，72℃25sec循环30次；72℃5min；

（3）杂交:首先配制杂交液，包括杂交缓冲液7.9μL、PCR扩增产物8μL、杂交阳性对照0.1μL，混匀后95℃变性8min,冰上放置5min，然后取其中15μL杂交液进行杂交；

（4）结果判读：用微阵列芯片扫描仪扫描分析，去除阴性对照背景，与芯片杂交说明对照，判定结果。

5.根据权利要求4所述检测方法，其特征是：所述杂交缓冲液每1000μL包括20×SSC500μL、10%SDS10μL及DEPCH₂O490μL。