[发明专利]一种从葡萄果实中大量提取总DNA的方法

权利要求书

1.一种从葡萄果实中提取总DNA的方法，所述方法，包括以下步骤：

步骤1，将葡萄果实磨成颗粒；

步骤2，颗粒用山梨醇提取，过滤掉多糖成分，余下葡萄渣1；

步骤3，葡萄渣1用巯基乙醇提取，过滤掉酚类成分；余下葡萄渣2

步骤4，葡萄渣2再用氯仿，异戊醇和KAc混合物提取，过滤掉蛋白成分，余下葡萄渣3，即为本发明的葡萄果实中的总DNA。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤如下：

(1)取新鲜或者冷冻的葡萄果实，加入液氮后使冻结，然后充分研磨得到冷冻颗粒；

(2)将冷冻颗粒加入离心管中，向离心管中加入缓冲液，山梨醇，巯基乙醇；

(3)震荡均匀后离心；

(4)将上清去掉，沉淀中加入缓冲液，CTAB，NaCl，EDTA和巯基乙醇；

(5)震荡温育；

(6)加入KAc，乙醇，氯仿；

(7)室温震荡，离心；

(8)上清转入一个新的离心管,加入等体积的氯仿；

(9)室温震荡，离心；

(10)上清转入一个新的离心管,加入LiCl和异丙醇,加入巯基乙醇,冷藏放置；

(11)离心；

(12)上清倒掉，沉淀干燥；

(13)加入DEPC溶解；

(14)得到DNA溶液；

(15)在溶解后的DNA溶液中加入RNA酶，混匀；

(16)放入37℃孵育；

(17)加入苯酚：氯仿混合溶液，离心；

(18)加入异丙醇和醋酸钠，冷藏放置；

(19)再离心；

(20)去掉上清，沉淀干燥加入TE保存。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤如下：

(1)取10g新鲜或者冷冻的葡萄果实,用液氮冻结后充分研磨；

(2)研磨后的果实加入预冷的50ml离心管中，向离心管中加入20ml清洗缓冲液(0.1M Tris-硼酸(pH7.4),0.35M山梨醇,10％PEG6000,2％巯基乙醇)；

(3)震荡均匀,4℃,8000rpm离心10min；

(4)将上清去掉,沉淀中加入15ml CTAB缓冲液(0.1M Tris-硼酸(pH7.4),2％CTAB,1.4M NaCl,20mmol/l EDTA(pH8.0)，2％巯基乙醇)；

(5)55℃温育30min(CTAB缓冲液可提前预热),温育期间手摇震荡几次；

(6)加入l.5ml的5M KAc,l.5ml的无水乙醇,15ml氯仿；

(7)放入摇床室温震荡20min,1000rpm离心10min；

(8)上清转入一个新的离心管,加入等体积的氯仿；

(9)放入摇床室温震荡20min,1000rpm离心l0min；

(10)上清转入一个新的离心管,加入1/3体积10M LiCl和0.8倍体积的预冷的异丙醇,加入1％巯基乙醇,-20℃放置2-4h；

(11)1000rpm离心30min；

(12)上清倒掉,沉淀在超净工作台中风吹干燥10min；

(13)加入500μl DEPC水溶解,放入50℃水浴中10min助溶；

(14)DNA溶液用移液器吸到2ml离心管；

(15)在溶解后的DNA溶液中加入5μl RNA酶，混匀；

(16)放入37℃，10min；

(17)加入500μl苯酚：氯仿(24：1)，12000rpm离心5分钟进行抽提，重复一次；

(18)加入2/3体积的冰冻异丙醇和1/10体积的3M醋酸钠，-20℃放置4小时；

(19)12000rpm离心5分钟；

(20)去掉上清，沉淀在超净工作台中风吹干燥10min；

(21)加入100μl TE溶解,放入50℃水浴中10min助溶；

(22)溶解的DNA可用于后续的试验。