[发明专利]一种不含外源DNA片段的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种不含外源DNA片段的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将GA2DH基因和PDC基因的上、下游片段分别引入重组整合型自杀质粒pJKM的多克隆位点，分别得到GA2DH基因的自杀型敲除质粒pΔGOX1231和PDC基因的自杀型敲除质粒pΔGOX1081；所述重组整合型自杀质粒pJKM带有SacB基因、抗生素标记和多克隆位点；

(2)将所得自杀型敲除质粒pΔGOX1231转入宿主菌中，依次经抗生素抗性筛选、无抗培养和蔗糖筛选，然后通过菌落PCR获取GA2DH基因敲除的阳性突变子，命名为G.oxydans ZJU1；

(3)将所得自杀型敲除质粒pΔGOX1081转入经传代后的G.oxydans ZJU1中，依次经抗生素抗性筛选、无抗培养和蔗糖筛选，然后通过菌落PCR获取PDC基因敲除的阳性突变子，即得氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌，命名为G.oxydans ZJU2。

2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述宿主菌为野生型氧化葡萄糖酸杆菌G.oxydans DSM2343。

3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，GA2DH基因和PDC基因的上、下游片段大小均为500-1200bp。

4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，重组整合型自杀质粒pJKM的制备方法如下：

(1)构建含SacB基因的克隆质粒pEASY-Blunt-SacB；

(2)取测序正确的克隆质粒pEASY-Blunt-SacB，通过SspI单酶切克隆质粒pEASY-Blunt-SacB和自杀质粒pK18mobGII，回收并连接、转化进E.coli DH5α，筛选获取SacB连接方向正确的阳性克隆，并培养E.coli DH5α，提取整合型质粒，即得所述重组整合型自杀质粒pJKM。

5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述抗生素抗性筛选是将转化子涂布于卡那霉素和头孢西丁的甘露醇培养基平板，得到基因组整合型转化子；所述蔗糖筛选是将所得基因组整合型转化子经甘露醇培养基试管培养后，划线于含有5～10％蔗糖和头孢西丁的甘露醇培养基平板，得到脱离自杀质粒的突变型菌株。

6.一种由权利要求1～5任一权利要求所述制备方法制备得到的不含外源DNA片段的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌。

7.一种如权利要求6所述氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌在生产5-酮基-D-葡萄糖酸中的应用。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，包括如下步骤：

将所述氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌经扩大培养后接种至发酵罐中进行发酵培养，收集发酵液。

9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述发酵培养基的组成为：玉米浆7.5g/L；(NH₄)₂SO₄0.41g/L；(NH₄)₂HPO₄0.1g/L；MgSO₄·7H₂O0.07g/L；CaCO₃10-20g/L(分开灭菌后加入)；葡萄糖100g/L，初始pH5.0-5.5，121℃，灭菌15min，头孢西丁终浓度50μg/mL。

10.根据权利要求8所述应用，其特征在于，发酵培养的条件为：28～32℃，0.8～1.2vvm的通气量，罐压0.02～0.04MPa，搅拌控制溶氧浓度为20％～40％，发酵55～65h，发酵过程中根据培养基中的葡萄糖浓度控制补料。