[发明专利]用于快速检测阪崎肠杆菌的纳米免疫传感器的制备方法及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于快速检测阪崎肠杆菌的纳米免疫传感器的制备方法，以及利用该制备方法制备出的纳米免疫传感器检测奶粉中的阪崎肠杆菌的检测方法。

背景技术

阪崎肠杆菌是一种常见的寄生在人和动物肠道内的革兰氏阴性无芽孢杆菌，有周生鞭毛、能运动、兼性厌氧，为肠道正常菌群之一。阪崎肠杆菌作为一种条件性致病菌，能导致严重的新生儿童脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症。并且可以导致神经系统后遗症甚至死亡，死亡率高达50％以上。婴幼儿奶粉作为携带阪崎肠杆菌的主要食品种类，近几年来连续引发了多起与食品安全相关的事件而备受国际相关组织，各国政府的高度重视和消费者的广泛关注。目前阪崎肠杆菌的分布及致病机制并不十分清楚，鉴于其潜在的危害，对于该菌的检测显得尤为重要。传统的阪崎肠杆菌检测方法，依赖于生化和形态学特征，国际上通常以美国食品药品监督管理局(FDA)和国际标准化组织(ISO)制定的检测方法为标准方法。2008年我国也制定了阪崎肠杆菌检验国家标准，并于2010年进行了修订，规范了阪崎肠杆菌检测。但传统的检测方法存在操作繁琐、耗时长、不易分辨结果等缺点。因此，目前许多工作研究者致力于开发更为快速、准确的阪崎肠杆菌的检测方法，以提高环境、食品阪崎肠杆菌的检测效率，同时要避免出现假阴性或假阳性的现象。

发明内容

本发明为解决上述技术的不足，提供一种用于快速检测阪崎肠杆菌的纳米免疫传感器的制备方法，还提供一种利用该制备方法制备出的纳米免疫传感器检测食品中阪崎肠杆菌的方法，本发明方法既具备了更加灵敏、快速、易微型化、便携的优势，同时也具备了免疫反应抗原-抗体结合的特异性，所以，在致病性微生物的快速检测中的应用日益受到各国学者的重视。

为解决以上问题，本发明采用以下技术方案：

本发明一种用于快速检测阪崎肠杆菌的纳米免疫传感器的制备方法，其特征是，以玻碳电极为基础电极，以聚酰胺树枝状大分子材料结合还原性石墨烯纳米复合物为电活性修饰膜层，具体将该纳米复合修饰物固定于玻碳电极表面，然后采用物理吸附法或采用牛血清白蛋白－戊二醛交联方法固定化辣根过氧化物酶标记的阪崎肠杆菌抗体制备而成纳米免疫传感器。

所述的用于快速检测阪崎肠杆菌的纳米免疫传感器的制备方法，包括以下步骤:

a.电极预处理

将玻碳电极用氧化铝抛光粉抛光打磨至镜面后用蒸馏水清洗干净，再依次用二次去离子水、无水乙醇、二次去离子水超声清洗3min～5min，用氮气吹干玻碳电极，然后,将pH值为7.0的磷酸盐缓冲液放入烧杯中,再加入铁氰化钾、氯化钾和过氧化氢,使其浓度分别为2mmol/L、0.1mol/L和0.5mmol/L，得到电解质溶液,然后将玻碳电极、Ag/AgCl参比电极和铂丝或铂片对电极插入上述电解质溶液中,连接PAR 270电化学工作站；用PAR 270电化学工作站进行循环伏安法扫描处理，扫描速度为50mV·s^-1，扫描电位范围在-0.2V～+0.6V之间，持续扫描直到循环伏安图稳定之后，取出玻碳电极用二次蒸馏水清洗净，用氮气吹干备用；

b.石墨烯-聚酰胺-胺复合物的制备

将一定量的石墨烯粉末加入到二次蒸馏水中，使其浓度为0.5mg/ml，搅拌1min～2min，并超声处理15min～20min，得到均匀一致的黑色石墨烯悬浮液,备用；

将2.0代聚酰胺-胺溶于体积浓度为1％的乙酸溶液中，使聚酰胺-胺的浓度为1.0×10^-3g/mL，室温的条件下，磁力搅拌55min～60min，得到聚酰胺-胺溶液，然后将聚酰胺-胺溶液和上述的石墨烯悬浮液按体积比1:1混合均匀，将混合溶液超声处理1.5h～2h，得到均匀稳定的石墨烯-聚酰胺-胺纳米复合物溶液；

c.免疫传感器的制备

准确量取3～8μL步骤b得到的石墨烯-聚酰胺-胺纳米复合物溶液滴涂到步骤a得到的玻碳电极表面，于室温下自然晾干或用便携式红外干燥器烘干，然后在玻碳电极表面滴涂与石墨烯-聚酰胺-胺纳米复合物同体积的辣根过氧化物酶标记的阪崎肠杆菌抗体,并置于4℃冰箱内反应1.5h～2h，再滴涂同体积的1wt％牛血清白蛋白溶液于37℃温度下处理55min～60min封闭非特异性吸附位点，将修饰后的电极取出，用二次去离子水冲洗去除未结合的多余辣根过氧化物酶标记的阪崎肠杆菌抗体，得到阪崎肠杆菌纳米免疫传感器，在4℃避光的条件下保存备用。

所述的用于快速检测阪崎肠杆菌的纳米免疫传感器的制备方法，所述步骤c中量取的步骤b得到的石墨烯-聚酰胺-胺纳米复合物溶液为5μL。