[发明专利]一种快速区分HP-PRRS活疫苗JXA1-R株与野毒株的HRM检测方法及其引物

权利要求书

1.一种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXA1-R株与野毒株的HRM检测方法的引物，其核苷酸序列如下所示：

引物P1：TCGCCRCGGGAGTCTGR(SEQ ID NO：1)，

引物P2：RGCGGAAACTTTGACCACTT(SEQ ID NO：2)，

引物P3：TGAGAAGAGGATTACGGCT(SEQ ID NO：3)，

引物P4：GGCCTGGTTGGGATCATAAG(SEQ ID NO：4)。

2.一种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXA1-R株与野毒株的HRM试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有权利要求1所述的引物。

3.一种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXA1-R株与野毒株的HRM检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)从样品中提取病毒核酸；

2)以核酸为模板，用权利要求1所述的引物对P1和P2进行预扩增反应获得预扩增产物；

3)以预扩增产物作为DNA模板，用权利要求1所述的引物对P3、P4及荧光饱和染料进行PCR-HRM扩增反应获得扩增产物；

4)对扩增产物进行HRM分析，确定病毒类型；

上述方法用于非疾病诊断和治疗。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤2)中PCR预扩增反应体系为：

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤2)中的预扩增反应程序为：50℃反转录30min；95℃预变性3min；95℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸60s；循环35次。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤3)中的PCR-HRM扩增反应体系为：

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤3)中的PCR-HRM扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸20s；循环35次；98℃变性2min，40℃杂合2min，60℃到85℃以0.3℃/s的熔解速率进行熔解曲线分析。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤4)中所述HRM分析的具体分析过程为：分别以72℃～74℃和84℃～86℃温度区间作为JXA1-R PCR-HRM扩增产物熔解曲线归一化温度区间，并分别以HP-PRRSV野毒株和JXA1-R疫苗毒株质粒样品为阳性对照对临床样品进行基因分型；与HP-PRRSV野毒株阳性对照进行比较时，若其基因分型置信值GCP大于或等于95％则判定为HP-PRRSV野毒株；与JXA1-R疫苗毒株阳性对照进行比较时，若其基因分型置信值GCP大于或等于95％则判定为JXA1-R疫苗毒株。