[发明专利]一种转子型的双红线粒体荧光探针及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于分子转子的高信噪比线粒体探针及其应用，尤其涉及一种适用于双光子荧光显微镜红外激发源和共焦显微镜多个激发波长的转子型的双红线粒体荧光探针及其在活细胞中的应用。

背景技术

线粒体是真核细胞内具有重要生理功能的细胞器之一，是细胞进行呼吸作用产生能量的重要场所。线粒体的形态和数量是可以变化的，而这些变化往往和人类疾病相关，例如帕金森氏病和老年痴呆症。因此，原位实时清晰地观察线粒体对于我们理解相关生理过程以及相应的疾病诊断和治疗是非常必要的。目前，基于各种机理、高效识别细胞内线粒体的荧光探针是成像活细胞内线粒体的有效工具。并且，高信噪比的探针有助于获得高保真度的荧光图片。

在生物成像中，红光发射的双光子荧光(双红)探针尤其适合成像活细胞内的靶标。首先，红光的波长范围处于生物光学窗口，其穿透力比短波长的光(蓝光和绿光)要强，从而能够得到更深的活细胞探测深度。而且红光光毒性低，对生物样品损伤小，便于观测。在红光区域，生物组织的受激自发荧光强度很低。其次，一个对比研究有力的说明了当成像深层活细胞和组织时，双光子荧光显微镜(TPM)比单光子共焦显微镜(LSM)有优势。TPM采用穿透力强的红外激光作为激发光源，大大降低了生物组织对激发光的吸收损耗，可用于活细胞及生物组织深层成像，同时大大降低了光漂白、光降解及光毒性问题，这些有利于延长对活细胞及组织的监测时间，而且可以有效的避免组织的自发荧光(自发荧光物质的激发波长一般都在350-560nm的范围内)。另外，由瑞利散射产生的背景噪音小，图像对比度高，且Stokes位移差别明显，易于探测。但是如果一个荧光探针的双光子吸收截面比较小，那么以上所述的TPM的优势则大打折扣。然而，由于单、双光子吸收遵循不同的选率，能用于LSM成像的探针有时并不适用于TPM。目前商业化的红光发射的线粒体探针双光子性能都比较低，因此开发双红线粒体探针是一个比较重要的课题。最近，Suzuki等人报道了一个能够成像HEK 293细胞中线粒体的双红探针AC(Tominaga,M.,et al.,2014.Chem.Lett.43,1490-1492.)。随后，Kawamata和Konishi等人设计合成了一个可以在光学窗口发光的线粒体探针PY，并用于HEK 293细胞中线粒体成像(Niko,Y.,et al.,2015.J.Mater.Chem.3,184-190.)。这两篇报道作者只是简单的将AC(Ex 750nm/Em 500-600nm)和PY(Ex 950nm/Em 600-700nm)应用于HEK 293细胞中线粒体成像，并没有给出探针的光稳定性，毒性以及透膜性能。尤其是PY探针需要16h才能进入细胞，这不得不让人担心细胞的状态。Xiao等人报道了一个双红线粒体探针DC-SPC-PPh3(Ex 900nm/Em 600-660nm)。孵育时间达1h，且探针在细胞中的双光子稳定性只能保持2分钟左右。Gryko等人最近报道了一个双红线粒体探针(Ex 760nm/Em 420-480nm)，但是作者在细胞成像实验时收集的波段却是蓝光420-480nm。最近，Kim等人报道了一个用来实时成像Cortical neurons中线粒体的双红探针CMT-red(Ex 820nm/Em 600-700nm)，并研究了探针的光稳定性(Sarkar,A.R.,et al.,2014.Anal.Chem.86,5638-5641.)。但是，目前既适合双光子显微镜使用，又适合共焦显微镜使用，且在活细胞内高选择性标记线粒体内的“双红”荧光探针研究的相对滞后限制了TPM技术在研究活细胞线粒体中的广泛应用。因此，对能在活细胞内使用“双红”线粒体探针的研究迫在眉睫。