[发明专利]一种癌细胞或细菌的捕获方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种癌细胞或细菌的捕获方法及其试剂盒。

背景技术

在生物医学领域，癌细胞和病原细菌是两类非常重要的生物靶标。对二者的高灵敏度分析检测对于相关疾病(癌症和病原细菌引起的感染疾病)的早期诊断来说，具有极为重要的意义。然而，大多数情况下待测样品中癌细胞及病原细菌的浓度比较低(痕量级别)，实现对其的直接生化分析和基因分型鉴定具有较大难度。因此在癌细胞和病原细菌的实际检测过程中，需经过一个“捕获-释放”的过程，首先对待测靶标进行有效捕获，实现对其的分离富集，然后再将富集的靶标释放并对其进行最终的生化分析和基因分型鉴定。因此，为实现对癌细胞和病原细菌的高灵敏度分析检测，发展一种有效的生物捕获及可控释放通用策略至关重要。

目前，针对癌细胞和病原细菌的捕获及可控释放技术主要有DNA适配体法、温控法和微流控法。DNA适配体法是基于DNA适配体对相应靶标高特异性的亲和能力来实现癌细胞和病原细菌的特异捕获，并利用DNA酶裂解适配体来实现捕获靶标的可控释放。温控法是基于热敏型聚合物在不同温度下其亲疏水性质的变化来实现癌细胞和病原细菌的温控捕获和释放。微流控法主要依据待测靶标尺寸的大小来构建相应的微流控捕获芯片，并通过控制微流剪切力的方向和大小来实现癌细胞和病原细菌的可控释放。

但是，DNA适配体法、温控法和微流控法都存在着各自的缺点。DNA适配体法无法实现可逆的靶标捕获和可控释放，只能满足单次癌细胞和病原细菌特异捕获和释放的要求。温控法涉及复杂的温敏聚合物合成步骤，其中使用的有机分子对生物靶标的活性有一定影响，从而降低了最终癌细胞和病原细菌的检测准确性和灵敏度。微流控法需根据不同靶标尺寸的大小精确控制微流控捕获芯片的结构，制备过程复杂，而且基于微流剪切力的靶标释放过程会降低癌细胞和病原细菌的活性。

因此，进一步建立一种针对癌细胞和病原细菌的生物捕获及可控释放通用策略十分必要。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种癌细胞或细菌的捕获方法及其试剂盒。该方法特异性强、灵敏度高，能够简便、快速、可逆地实现癌细胞或细菌的捕获及释放，且对癌细胞或细菌的生物活性影响较小。

为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种癌细胞或细菌的捕获方法，该方法将NTA功能化载体与含有靶标结合蛋白和Ni²⁺的样品共同孵育；靶标结合蛋白中包括组氨酸标签和能够与癌细胞或细菌特异性结合的蛋白或抗体。

NTA为次氮基三乙酸，组氨酸标签(His-tag)为多个成串组氨酸的肽段。研究表明，NTA在Ni²⁺存在条件下会与含有组氨酸(His)的分子通过螯合作用非共价结合到一起，且此非共价结合作用在有螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))存在的情况下可被打破。本发明利用该原理，构建了NTA功能化载体，使其在Ni²⁺存在的条件下，与靶标蛋白(携带有His-tag的能够与癌细胞或细菌特异性结合的蛋白或抗体)相结合，进而实现对癌细胞或细菌的捕获。由于靶标结合蛋白与细胞或细菌的结合为特异性结合，所以所捕获的癌细胞或细菌皆可具有良好的纯度。经实验证实，采用本发明提供的方法对癌细胞的捕获率可达95％；对细菌的捕获率可达96％。当需要将癌细胞或细菌释放时，以含有金属离子螯合剂的溶液作为释放剂，便可实现癌细胞或细菌的释放。实验表明，使用本发明提供的方法在捕获后，对癌细胞的释放率可达87％，对细菌的释放率可达85％，且对癌细胞或细菌的生物活性影响较小。

在本发明的实施例中，因转铁蛋白(TRF)对癌细胞具有特异性结合的能力。而伴刀豆蛋白(ConA)对细菌具有特异性结合能力。因而本发明选用了His-tag转铁蛋白作为捕获癌细胞的靶标结合蛋白，而选择His-tag伴刀豆蛋白作为捕获细菌的靶标结合蛋白。

在本发明提供的一些实施例中，His-tag-转铁蛋白的浓度为30μg/mL。

在本发明提供的一些实施例中，His-tag-伴刀豆蛋白的浓度为30μg/mL。

在本发明提供的一些实施例中，His-tag中组氨酸的个数为6个。

在本发明提供的一些实施例中，采用His-tag转铁蛋白捕获宫颈癌细胞；采用His-tag-伴刀豆蛋白捕获大肠杆菌。

本发明对结合剂中的阴离子不做限定，在一些实施例中，Ni²⁺由硝酸镍或硫酸镍提供。