[发明专利]一种具有大双光子荧光活性截面的膜通透性染料及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种双光子染料及其应用，尤其涉及一种具有大双光子荧光活性截面的膜通透性染料及其应用。

背景技术

双光子显微镜的发展已经彻底改变了对器官和组织、特别是厚的或高散射的标本的观测。与单光子激光共聚焦显微镜相比，双光子显微镜具有诸如近红外光激发、避免荧光漂白和光致毒、高分辨率、减小组织吸光及降低组织自发荧光干扰等特点。但是，如果所用荧光探针的双光子吸收截面小(与生物样品的内源性发光物质相近)，那么双光子显微镜优势会被大打折扣。因为染料的单、双光子吸收服从不同的选律，所以优良的单光子染料不一定具有大的双光子吸收截面。目前用于激光共聚焦显微镜的单光子染料几乎都不具备大的双光子荧光活性吸收截面。因而，针对该技术的双子染料和探针的研究成为一个热门课题。

最近，许多课题组报道了大量的双光子染料和探针。虽然近期报道的双光子染料具有大的双光子荧光活性吸收截面，但是常用的双光子染料依旧是罗丹明(吸收截面只有200GM左右)。这是因为罗丹明具有良好的膜通透性。细胞膜通透性是一个优良生物荧光染料的重要参数。目前，生物荧光成像中所使用的染料很少同时具备大的双光子荧光活性吸收截面和良好的细胞膜通透性。这在很大程度上制约了利用双光子三维成像技术进行细胞生物成像与观测。因而开发、研制具有实际应用价值的双光子膜通透性荧光染料是当务之急。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种具有大双光子荧光活性截面的膜通透性染料及其应用。

本发明所述具有大双光子荧光活性截面的膜通透性染料，其特征在于：所述染料是三苯胺杂环类化合物，其化学结构通式如式(I)所示：

其中：上述式中R表示NH或S原子。

上述具有大双光子荧光活性截面的膜通透性染料通式(I)中所述R优选表示S原子。

上述具有大双光子荧光活性截面的膜通透性染料具体优选是4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]-N-{4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]苯基}-N-苯基苯胺。

本发明所述具有大双光子荧光活性截面的膜通透性染料(三苯胺杂环类化合物)的制备方法概述如下：

发明人首先通过wilsmeier反应在三苯胺上引入两个醛基，然后利用wittig反应再引入两个双键，最后利用与邻巯基苯胺、邻二苯胺、或邻羟基苯胺的扣环反应得到终产物——三苯胺杂环类化合物。

上述三苯胺杂环类化合物具体制备反应式如下：

本发明所述具有大双光子荧光活性截面的膜通透性染料在显示活细胞中细胞质双光子成像中的应用。

其中，所述活细胞优选为HeLa细胞或RBL-2H3细胞；在细胞质中无靶向性。

试验结果证实，本发明所述具有大双光子荧光活性截面的膜通透性染料(三苯胺杂环类化合物)能够很容易的通过细胞膜，在细胞质区域呈现出明显的荧光显微图像，这为应用双光子显微镜成像活细胞中细胞质的研究提供了有益的帮助，同时也为开发简捷、直观的荧光检测试剂提供了技术支持。

本发明的有益效果是：利用实验筛选，本发明确立了一类新型具有大双光子荧光活性截面的膜通透性染料，即三苯胺杂环类化合物。本发明所述三苯胺杂环类化合物具有价格低、激发能量低、显色强、生物相溶性较好的特点。进一步的试验证实，本发明的三苯胺杂环类化合物具有比较大的双光子荧光活性吸收截面、优秀的细胞膜通透性和低毒性等特点。并且本发明所述的染料和已有的探针DAPI具有良好生物相容性，在激光激发荧光生物标记领域具有潜在的应用价值。也预示本发明所述三苯胺杂环类化合物作为双光子荧光染料具有广阔应用前景。

附图说明

图1：4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]-N-{4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]苯基}-N-苯基苯胺对活性Hela和RBL-2H3细胞进行染色在单光子共聚焦荧光显微镜下得到的荧光显微照片。

其中a图为用4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]-N-{4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]苯基}-N-苯基苯胺染色得到的荧光显微照片；b图为明场照片；c图为左中两图的合并图即共定位图。

图2：4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]-N-{4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]苯基}-N-苯基苯胺对活性Hela和RBL-2H3细胞进行染色后在800纳米激光辐照下得到的双光子荧光显微照片。