[发明专利]干扰猪PACAP基因表达的siRNA、载体及应用

说明书

本发明涉及一种干扰猪PACAP基因表达的siRNA及其shRNA，以及利用该shRNA构建的慢病毒介导的猪PACAP基因干扰载体及应用。所属干扰猪PACAP基因表达的siRNA和shRNA，其序列分别如SEQ ID No.1和2所示。本发明设计的siRNA能够有效降低PACAP基因和蛋白的表达，利用其shRNA构建的慢病毒介导的猪PACAP基因RNA干扰载体，能够显著降低PACAP基因在细胞内的表达，为研究猪GH调控、转基因高瘦肉率猪提供了研究基础。

(一)技术领域

本发明涉及一种干扰猪PACAP基因表达的siRNA及其shRNA，以及利用该shRNA构建的慢病毒介导的猪PACAP基因干扰载体及应用。

(二)背景技术

慢病毒载体是一类逆转录病毒载体，以其转染效率高，可感染分裂期和非分裂期细胞，可容纳较大的基因片段等优点，现已被作为转移目的基因的理想载体。而RNA干扰技术是近年来迅速发展起来可以特异性地剔除特定基因或者抑制特定基因表达的一种新技术，在病毒感染、心血管疾病、肿瘤等疾病的治疗中被广泛应用。慢病毒载体介导的RNA干扰，是将慢病毒载体高效感染的特性与RNA干扰特异性抑制同源基因表达的作用结合起来，有望为特定基因的功能以及相关疾病的治疗研究提供新的手段和方法。

垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)由下丘脑合成并分泌，具有多种生理功能，其中刺激生长激素(GH)的释放是其重要功能之一。利用慢病毒介导的猪PACAP基因RNA干扰载体，能够显著降低PACAP基因在细胞内的表达，为研究猪GH调控、转基因高瘦肉率猪提供了研究基础。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种干扰猪PACAP基因表达的siRNA及其shRNA，以及利用该shRNA构建的慢病毒介导的猪PACAP基因干扰载体及应用。

本发明采用的技术方案是：

干扰猪PACAP基因表达的siRNA，其序列如SEQ ID No.1所示：5’-GCTACAGCCGCTATCGGAAACAAAT-3’。该干扰序列为人工设计，能够有效的降低目的细胞PACAP基因和蛋白的表达，荧光定量PCR结果显示PACAP基因的表达量下降了90％，Western blot结果显示PACAP蛋白表达量下降了88％。

干扰猪PACAP基因表达的shRNA，其序列如SEQ ID No.2所示：5’-GATCGCTACAGCCGCTATCGGAAACAAATTTCAAGAGAATTTGTTTCCGATAGCGGCTGTAGCTTTTTTC-3’。由于直接导入外源的siRNA的话其作用时间有限(一般只有几天)，需要稳定表达的siRNA就有了shRNA，shRNA是在设计的两段siRNA两边加上一段序列、中间加上一段loop序列以后形成的，可以连接到载体上、并通过载体能进入细胞中稳定表达的形式。

本发明还涉及利用所述shRNA构建的慢病毒介导的猪PACAP基因干扰载体，由所述shRNA插入pLV-U6-Zsgreen载体中获得，所述pLV-U6-Zsgreen载体质粒图谱如图1所示，其中U6启动子后为MCS区，目的片断shRNA插入BamHI，EcoRI位点。

本发明还涉及所述siRNA在猪生长激素调控中的应用。

本发明还涉及所述siRNA在培育转基因高瘦肉率猪中的应用。

本发明的有益效果主要体现在：本发明设计的siRNA能够有效降低PACAP基因和蛋白的表达，利用其shRNA构建的慢病毒介导的猪PACAP基因RNA干扰载体，能够显著降低PACAP基因在细胞内的表达，为研究猪GH调控、转基因高瘦肉率猪提供了研究基础。

(四)附图说明

图1为pLV-U6-Zsgreen干扰载体质粒图谱；

图2为PACAP shRNA1测序结果；