[发明专利]纳米孔阵列的人气味结合蛋白传感器的制备方法与应用

权利要求书

1.一种纳米孔阵列的人气味结合蛋白传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)加工纳米孔阵列材料：采用标准的两步阳极氧化法制备；将纯度为99.99％以上的铝箔裁剪成长×宽为20mm×20mm的基片，进行机械抛光后依次在超纯水、丙酮溶液中，用超声脱脂清洗10min，取出后用超纯水淋洗，用氮气吹干后以基片作为阳极，铜片作为阴极在0.25M的草酸中进行一次氧化3h，然后用超纯水淋洗后把基片放入质量百分比为4％的铬酸和质量百分比为8％的磷酸混合液中进行5min刻蚀，除去一次阳极氧化多孔氧化铝层，然后用超纯水淋洗后进行15min的二次氧化，条件与第一次氧化条件完全相同，第二次刻蚀溶液为质量百分比为8％的磷酸和0.1M的氯化铜混合溶液，时间为5min，取出基片，用超纯水淋洗后即得到纳米孔阵列材料；

(2)纳米孔阵列的人气味结合蛋白传感器的构建，该步骤通过以下子步骤来实现：

(2.1)首先，将纳米孔阵列材料裁剪成3mm*3mm的纳米孔阵列，面积大于反应皿中间通道，然后将其固定于反应皿的中间，再向反应皿的两侧中加入超纯水，浸泡24h后，依次用无水乙醇和超纯水清洗上述的反应皿及纳米孔阵列，最后用氮气吹干；

(2.2)配制5mM的2-羧乙基磷酸溶液，溶剂为超纯水；将2-羧乙基磷酸溶液加入反应皿的两侧，2-羧乙基磷酸溶液体积为使得纳米孔阵列恰好完全浸泡在2-羧乙基磷酸溶液中；在室温下，避光静置72h，2-羧乙基磷酸中的磷酸根吸附于纳米孔阵列的表面，进而将2-羧乙基磷酸固定于纳米孔阵列上；之后再吸出反应皿中残留的2-羧乙基磷酸溶液，然后用超纯水清洗反应皿及纳米孔阵列，最后用氮气吹干；

(2.3)在反应皿的两侧分别加入8mg/ml的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)溶液和12mg/ml的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)溶液，EDC溶液和NHS溶液的体积均为2-羧乙基磷酸溶液体积的二分之一，EDC溶液的溶剂为0.1M MES缓冲液，NHS溶液的溶剂为0.1M PBS缓冲液，室温下静置15min后，再加入饱和NaHCO₃溶液调节反应皿中溶液pH至7.2-7.4；

(2.4)在反应皿的两侧分别加入与EDC溶液等体积的20μg/ml人气味结合蛋白溶液，人气味结合蛋白溶液的溶质为人气味结合蛋白，溶剂为0.1M PBS缓冲液，内含质量百分比为5％的海藻糖和质量百分比为5％的甘露醇；将反应皿置于4℃条件下静置2h，使得人气味结合蛋白与2-羧乙基磷酸溶液中的2-羧乙基磷酸的羧基发生脱水缩合作用而形成稳定的酰胺键，进而形成酰胺键结构，然后吸出反应皿中残留的液体，再向反应皿两侧加满0.1M PBS缓冲液，静置5min后吸出PBS缓冲液，即可获得基于纳米孔阵列的人气味结合蛋白传感器，置于4℃条件下备用。

2.一种应用权利要求1所述制备方法制备得到的纳米孔阵列的人气味结合蛋白传感器检测脂肪酸和醛类物质的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)配制苯甲醛和二十二碳六烯酸的标准样品溶液：采用分析纯为99％的苯甲醛和分析纯为99％的二十二碳六烯酸标准贮备溶液分别稀释配制5种不同浓度梯度的标准样品溶液，稀释液是分析纯为99％的甲醇溶液；

(2)纳米孔阵列的人气味结合蛋白传感器构建的表征：首先是三电极检测系统的连接，先将三电极中金工作电极的一端连接电化学工作站的工作输入端，金工作电极的另一端插入反应皿中；银/氯化银参比电极的一端连接电化学工作站的参比输入端，铂丝对电极的一端连接电化学工作站的对电极输入端；银/氯化银参比电极和铂丝对电极的另外一端同时插入反应皿的另外一侧；当反应皿中间没有纳米孔阵列时，向反应皿的两侧中分别加入与2-羧乙基磷酸溶液等体积氧化还原对溶液，氧化还原对溶液中含有10mM铁氰化钾、10mM亚铁氰化钾和0.1M的KCl，溶剂为超纯水，再向反应皿的两侧中分别加入与氧化还原对溶液等体积的甲醇溶液，直接进行电化学阻抗图谱扫描，具体测试参数为初始电压为0.2V，交流电压幅度为5mV，扫频范围为1Hz～1MHz，最后得到无纳米孔阵列的电化学阻抗图谱；之后利用相同的测量方法，测量纳米孔阵列固定于反应皿中的电化学阻抗图谱，以及纳米孔阵列上固定人气味结合蛋白之后的电化学阻抗图谱，利用检测到的三条电化学阻抗图谱表征纳米孔阵列的人气味结合蛋白传感器的构建；

(3)检测苯甲醛标准样品溶液：三电极检测系统的连接及具体测试参数同步骤2，测试传感器是纳米孔阵列的人气味结合蛋白传感器，首先进行空白对照溶液电化学阻抗图谱的测量，向反应皿的两侧中分别加入与2-羧乙基磷酸溶液等体积的氧化还原对溶液，氧化还原对溶液中含有10mM铁氰化钾、10mM亚铁氰化钾和0.1M的KCl，溶剂为超纯水，再向反应皿的两侧中分别加入与氧化还原对溶液等体积的甲醇溶液，通过电化学工作站对纳米孔阵列的人气味结合蛋白传感器进行电化学阻抗图谱扫描，得到电化学阻抗图谱；测量结束后吸出反应皿两侧中残留的溶液，然后向反应皿的两侧均加满PBS缓冲液，静置5min后缓慢吸出PBS缓冲液，用于清洗纳米孔阵列，消除上次测量残留的铁氰化钾/亚铁氰化钾及PBS缓冲液的混合溶液影响；之后再进行苯甲醛标准样品溶液的检测，向反应皿的两侧分别加入与2-羧乙基磷酸溶液等体积的氧化还原对溶液和已知物质的量浓度的苯甲醛标准样品溶液，进行电化学阻抗图谱的测量，得到该物质的量浓度下的苯甲醛标准样品溶液对应的电化学阻抗图谱；测量结束后吸出反应皿两侧中残留的溶液，然后向反应皿的两侧均加满PBS缓冲液，静置5min后缓慢吸出PBS缓冲液，用于清洗纳米孔阵列；

(4)重复步骤3中苯甲醛标准样品溶液的电化学阻抗图谱的测量过程，直至完成5种不同浓度梯度的苯甲醛标准样品溶液的测量，得到不同浓度下的电化学阻抗图谱；

(5)建立纳米孔阵列的人气味结合蛋白传感器的等效电路模型：三电极检测系统由经典Randles模型等效，包含溶液阻抗R_s,电子转移电阻R_ct,Warburg阻抗Z_w,及常相角元件CPE；纳米孔阵列等效电路为纳米孔电阻R_pore和纳米孔电容C_pore的并联电路；人气味结合蛋白的等效电路为人气味结合蛋白电阻R_p和人气味结合蛋白电容C_p的并联电路；其中，随着苯甲醛标准样品溶液的浓度增加，人气味结合蛋白修饰的纳米孔阵列阻抗R在增加，其中R＝(R_pore+R_p)/2；

(6)建立苯甲醛分子标准浓度-归一化阻抗曲线：利用步骤2-4中检测到的空白溶液和5种不同浓度梯度下的苯甲醛标准样品溶液的电化学阻抗图谱，和步骤5建立的等效电路模型计算人气味结合蛋白修饰的纳米孔阵列阻抗R，从而计算归一化阻抗，即标准样品溶液对应的人气味结合蛋白修饰的纳米孔阵列阻抗R₁与空白对照溶液对应的人气味结合蛋白修饰的纳米孔阵列阻抗R₀的差值相对于空白对照溶液对应的人气味结合蛋白修饰的纳米孔阵列阻抗R₀的变化百分比(R₁-R₀)/R₀，得到苯甲醛标准样品溶液浓度与归一化阻抗之间的关系曲线y＝ax+b，其中，x为苯甲醛标准样品溶液浓度，y为归一化阻抗，a和b为常数，实现对苯甲醛分子的检测；

(7)检测二十二碳六烯酸标准样品溶液，建立二十二碳六烯酸分子标准浓度-归一化阻抗曲线，方法同步骤2-6，最终得到5种不同浓度梯度下的二十二碳六烯酸标准样品溶液的电化学阻抗图谱与二十二碳六烯酸分子标准浓度-归一化阻抗曲线；

(8)完成待测苯甲醛样品溶液和待测二十二碳六烯酸样品溶液的检测，测量得到待测苯甲醛样品溶液和待测二十二碳六烯酸样品溶液的电化学阻抗图谱及归一化阻抗，对应得出待测苯甲醛样品溶液和待测二十二碳六烯酸样品溶液的浓度。