[发明专利]L-色氨酸的发酵生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，具体地说，涉及L-色氨酸的发酵生产方法。

背景技术

色氨酸又名α-氨基-β-吲哚丙酸，它有D-型和L-型两种异构体，天然存在的只有L-色氨酸。L-色氨酸是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸，学名：β-吲哚基丙氨酸；英文名Tryptophan，分子式C₁₁H₁₂N₂O₂,相对分子量204.21，熔点289℃。L-色氨酸为白色或微黄色结晶或结晶性粉体，无臭味微苦。在水中微溶，在乙醇中极微溶解。它广泛存在于天然蛋白质中。L-色氨酸对人体和动物的生长发育、新陈代谢起着重要作用，被广泛用于医药和食品、饲料等领域。近年来，随着色氨酸在医药、食品和饲料等方面的应用，其市场需求量在不断增加。

L-色氨酸的生产方法包括化学合成法、蛋白质水解法、酶促转化法和发酵法。由于化学合成法和蛋白质水解法需要大量的有机溶剂，存在原料来源和环境污染等问题，在生产中极少使用。酶促转化法成本较高，污染量大。微生物发酵法生产L-色氨酸具有产率高、周期短、控制容易等优点。发酵法大体可以分为直接发酵法、微生物转化法和酶法。近年来还出现直接发酵法与转化法相结合生产色氨酸的相关报道。另外，重组DNA技术在微生物育种和工业上的应用极大地推动了直接发酵法和酶法生产色氨酸的工业化进程。

随着L-色氨酸市场需求激增，越来越多的研究者和科研机构开始对L-色氨酸发酵进行全面的研究。然而，随着粮食价格的普遍上涨和国家对用粮食作物用于规模生产进行调控，使之成为影响L-色氨酸发酵的主要因素，因此寻求粮食替代品，从而降低生产成本成为新的研究目标。

发明内容

本发明的目的是提供一种以木薯为原料发酵生产L-色氨酸的方法。

为了实现本发明目的，本发明提供的L-色氨酸的发酵生产方法，是以保藏编号为CICC10303的大肠杆菌基因工程菌(Escherichiacoli)作为发酵菌株，通过补料批式发酵生产L-色氨酸；其中，发酵培养基中的碳源以及补料时流加的糖液是以木薯为原料制备的葡萄糖液。

前述的方法，以木薯为原料制备葡萄糖液包括以下步骤：

1)将木薯进行筛选后(去除发霉变色的原料)，用粉碎机进行粉碎，过20-40目(优选30目)筛去除大颗粒后，加水溶解成乳浆；其中，木薯与水的重量比为1:2-2.5(优选1:2.3)；

2)向乳浆中加入高温淀粉酶，在65-72℃保温20-40min(优选保温30min)，再糊化升温至95-98℃保温4-8min(优选保温5min)，得木薯液化液；其中，每升乳浆中添加高温淀粉酶的量为0.2ml，其中淀粉酶的酶活为94731U/ml；

3)用板框压滤机压滤木薯液化液，所得滤液即为葡萄糖液；其中，压滤温度为75-85℃，压滤机压力为0.15-0.3MPa。

具体地，本发明提供的L-色氨酸的发酵生产方法包括以下步骤：

i)种子液的制备：按0.1％-0.2％(v/v)的接种量将OD₆₀₀为0.7-1.0(优选OD₆₀₀＝0.8)的菌液接种到种子罐培养基中，在30-33℃、0.03-0.1MPa、通风比1:0.2-0.4v/v·min、转速250-300rpm、pH6.8-7.2的条件下培养14-18h，得OD₆₀₀为0.7-1.0(优选OD₆₀₀＝0.8)的种子液；

ii)按10％-15％(v/v)的接种量将种子液接种到发酵培养基中，在30-33℃、0.03-0.1MPa、通风比1:0.2-0.8v/v·min、转速250-350rpm、pH6.8-7.2的条件下发酵38-40h，并以流加方式添加制备的葡萄糖液，使葡萄糖液的浓度始终保持在3.5％-4.5％。

其中，种子罐培养基的成分为：葡萄糖5％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸镁0.1％，水94.7％，pH6.8-7.2，使用前经121℃蒸气灭菌25min；发酵培养基的成分为：葡萄糖15％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸镁0.1％，葡萄糖液3.5％-4.5％，余量为水，pH6.8-7.2，使用前经115℃蒸气灭菌20min。

前述的方法，步骤i)和ii)中通入的空气为经过0.25-0.3MPa压缩、过滤后的无菌空气。无菌空气压缩、过滤所用设备为通用的空气压缩机和空气净化系统。

前述的方法，步骤ii)中流加的葡萄糖液经过115℃蒸气灭菌20min后加入。