[发明专利]用于质谱鉴定的革兰氏细菌蛋白质处理方法及其缓冲溶液

说明书

技术领域

本申请涉及微生物质谱鉴定领域，尤其涉及一种用于质谱鉴定的革兰氏细菌蛋白质处理方法及其缓冲溶液。

背景技术

未知微生物的鉴定技术发展由久以来，通常在描述微生物鉴定结论中最基本的单位为属和种。分类单位中最小的单位菌株是来自同一单个细胞的后代纯培养。传统的做法是利用化学方法进行细菌的鉴定，有时候也称之为细菌化学分类。分类的标准可依据若干多个化学分类指标，可以依据某些组分的有无，或者某些化合物丰度的比率，来获得一个显著的分类指纹图谱。

随着化学仪器的发展，该领域的先驱者CatherineFenselau所著ACSSymposiumSeries将所有发展的质谱技术用于细菌化学分类。当基质辅助激光解析离子化(Matrix-assistedlaserdesorptionionization，MALDI)成功的应用到蛋白质组学时，开始有人利用该技术分析细菌蛋白质，其中包括可以用于细菌分类的蛋白质。

基质辅助激光解析离子化(MALDI)是众多气化和离子化方法之一，飞行时间质量分析器(TOF)是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比(M/Z)与离子的飞行时间成正比，从而检测离子。MALDI-TOF实际上实现了一步完成气化和离子化。分析物首先由固相或液相变成气相离子，通常情况下是进行气化，有些粒子在高度真空的环境下很容易气化，但是有些分子要在加热时分解，如生物大分子蛋白等。MALDI-TOF能够实现在不破坏分子结构的前提下实现由固相到气相的转变。在MALDI-TOF过程中，分析物首先被大量的基质包裹，并涂在样品盘表面。样品盘通常是由不锈钢制成，样品的溶液能在样品盘上很快挥发，通常是水、乙腈/水或者丙酮/水。基质通常是一种弱酸，并且能够吸收激光，由于基质对一定波长的激光具有强吸收，因此，无论分析物是否有吸光性基质或分析物在固相层都会发生很强的反应。在经过激光轰击后，被击中的样品点很快被加热并且获得动能后开始从样品板上脱离下来，这样基质连同分析物一起气化，由于基质通常是弱酸，一些极性的分析物如蛋白质，能够从基质的羧酸基团中获得质子，在质量分析器中通过分析物的质荷比的不同进行分离检测。MALDI-TOF作为微生物鉴定的方法关键点在于分辨率。因为细菌全细胞是一个非常复杂的混合体，而且整个过程没有前期的分离纯化，所以MALDI-TOF所得结果是一个用于细菌鉴定的平均值，而对于特异蛋白质分析相对有限。

传统的微生物分类包括表型分类、生理生化分类等方式，其归根结底都是微生物蛋白质差异的不同表现形式。而直接利用蛋白质进行微生物分类更能反映出不同微生物之间区别的本质，是最有效、最本质的微生物分类和鉴定方法。以高通量的MALDI-TOF为基础开发的微生物鉴定系统，基于质谱的蛋白质组学技术MALDIBioTyper系统在微生物鉴定和分类的应用，可实现三方面的工作：①对于一系列已知微生物，可获得MALDI-TOFMS数据库，即建立已知微生物的标准蛋白质组指纹质谱数据库；②对于未知微生物，则制备未鉴定微生物样品，利用MALDI-TOFMS获得质谱数据，再采用提供的软件包，将获得的质谱数据与已知微生物的标准蛋白质组指纹质谱数据库进行比较，以鉴定具有相同或相似质谱数据的已知微生物，再建立未知微生物的标准蛋白质组指纹质谱数据库；③采用提供的软件包工具，可以利用已建立的已知和未知微生物标准蛋白质组指纹质谱数据库用于临床、环境、工业未知样品的鉴定。由质谱检测得到的蛋白指纹应用于微生物鉴定。这项技术仅需要极少量的样品和处理费用，就可以快速鉴定出不明细菌、酵母菌和霉菌，能极好地替代经典的微生物鉴定和分类技术。

但传统的应用于质谱鉴定的革兰氏阴性菌蛋白质的处理方法，如应用于革兰氏阴性菌的乙醇/甲酸法，将一定量的菌落纯培养(5-10mg)放入离心管中，加入300μl水混匀，加入900μl乙醇混匀，以最大速度(15000rpm)离心2min，除去上清液，重复离心，完全除去乙醇，加入50μl70％的甲酸，重新悬浮所有菌落，并且剧烈震荡1min，加入50μl纯乙腈混匀，最大速度(15000rpm)离心2min，转移上清液到一个新的离心管中，样品制备完毕可直接进行鉴定。