[发明专利]一种鲫鱼降压肽的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及降压肽的制备方法，尤其是一种鲫鱼降压肽的制备方法。

背景技术

血管紧张素转换酶(ACE) 是一种含锌的二肽羧酸基肽酶，对调节血压起着关键性的作用，血管紧张素I(AngiotensinI) 不具有活性，但是AngI 在ACE 的作用下可以转变为具有活性的血管紧张素II，AngII 具有收缩血管平滑肌的活性功能，从而引起血压升高。ACE抑制肽是对ACE 活性区域亲和力较强的竞争性抑制剂，它们与ACE 的活性中心的亲和力比AngI 或舒缓激肽对ACE 的亲和力更强，并且降血压肽一旦和ACE 活性中心结合，就难以释放出来，从而阻碍AngI 转化为AngII 以及催化水解舒缓激肽成为失活片段，起降血压作用。

食源性蛋白通过不同的酶进行酶解，在其酶解物中发现了许多ACE 抑制肽，这些ACE 抑制肽安全、新颖、高效。目前报道的ACE 抑制肽主要来源于牛奶、大豆、乳酪、鸡蛋、蛇毒、玉米、食用菌等，水产动物蛋白也陆续报道，如马氏珠母贝、鲨鱼、草鱼等。鲫鱼肉质细嫩，肉营养价值很高，每百克肉含蛋白质 13克、脂肪 11克，并含有大量的钙、磷、铁等矿物质。中医认为，鲫鱼药用价值极高，其性平味甘，具有益气健脾、消润胃阴、利尿消肿、清热解毒之功能，并有降低胆固醇的作用；用鲫鱼可治疗口疮、腹水、水乳等症，常食鲫鱼，可以防治高血压、动脉硬化、冠心病。目前对鲫鱼降血压肽研究鲜见报道。

发明内容

本发明的目的是为提供一种鲫鱼降压肽的制备方法，其技术方案如下：

本发明所述的一种鲫鱼降压肽的制备方法，具体步骤如下：

(1) 酶解鲫鱼蛋白制备酶解液

将鲫鱼肉绞成肉糜，加水打浆，然后加入2‰(w/w) 活力6×10⁵U/g 的木瓜蛋白酶，调节pH 值到5.5-6.0，温度55-60℃，搅拌酶解5 小时，灭酶，转速3000rpm 离心20min，取上清液，即酶解液；

(2) 从酶解液中分离纯化降血压肽

酶解液经2％活性碳脱色20min，然后过2000Da 的超滤膜超滤，将超滤小于2000Da 的超滤液过Sephadex G-15 柱，流速1.0mL/min，用蛋白质核酸检测仪，在280nm 处进行检测，自动部分收集仪收集洗脱液，冻干称重后，测定ACE 抑制活性，将抑制活性高的组分多次收集，然后进一步用反相高效液相色谱分离；半制备柱ZORBAX SB-C18，流速0.8mL/min，流动相：A ：含0.1％ (v/v)TFA 的水；B ：含0.1％ (v/v)TFA 的乙腈，洗脱液在波长280nm 下进行检测，同一峰下的组分收集混合，冷冻干燥，测定ACE 抑制活性，得到高活性的ACE 抑制肽；

(3) 降血压肽的序列测定

将分离纯化得到的具有高活力的ACE 抑制肽，用6N 的HCl 在110℃全水解24 小时，用氨基酸自动测定仪测定氨基酸组成；同时，通过质谱仪分析肽的分子量和肽段的分布，进行肽的氨基酸序列分析。

所述的步骤(2) 中测定肽的ACE 抑制活性方法优选的是以N-[3-(2- 呋喃) 丙烯醇酰]-2- 苯丙氨酰甘氨酰甘氨酸(FAPGG) 为AngI 模拟物的分光光度法，在酶标仪(LB941Tristar，BertholdTechnologies，Bad Wilbad，Germany) 上测定。FAPGG 在ACE 的水解下生成N-[3-(2- 呋喃) 丙烯醇酰]-2- 苯丙氨酸(FAP) 和双甘肽(GG)，FAPGG 的水解使340nm 吸光度降低，降低速率与样品的ACE 活性成正比。具体步骤如下：

将10μL 的ACE 溶液(0.25U/mL) 和10μL 的蛋白酶解液加入微孔板的微孔中但不混合，然后加入150μL 经过预热的1mM FAPGG( 溶剂为50mM Tris-HCl 缓冲液，pH 7.5，含0.3M NaCl)，使其开始反应。同时，迅速将微孔板放入酶标仪中并加热到37℃，每1min纪录一次在340nm 下的吸光值，共记录20min。空白对照用10μL 缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5， 含0.3MNaCl) 代替蛋白酶解液。以吸光值对时间做出曲线，计算出斜率( 通常取10-20min 的斜率来计算)。

ACE 抑制活性(％ ) ＝ (1- △ A 抑制剂/ △ A 空白)×100

△ A _抑制剂：样品的吸光值对时间曲线的斜率，△ A_空白：空白的吸光值对时间曲线的斜率。