[发明专利]替换VLQ表位的重组蛋白及其编码核苷酸和应用

说明书

本发明属于医药生物领域，具体涉及GPC3‑HBsAg重组蛋白及其肿瘤疫苗中的应用。所述重组蛋白为重组的乙肝表面抗原(HBsAg)，具体是HBsAg内源性CTL表位被其他外源CTL表位替换的重组蛋白；所述其他外源CTL表位为GPC3的CTL表位。

技术领域

本发明属于医药生物领域，具体涉及GPC3-HBsAg重组蛋白及其编码核苷酸和应用。

背景技术

磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glypican)家族是存在于细胞表面上的硫酸乙酰肝素蛋白多糖的新家族。迄今已报告有五种磷脂酰肌醇蛋白聚糖(磷脂酰肌醇蛋白聚糖1，磷脂酰肌醇蛋白聚糖2，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3，磷脂酰肌醇蛋白聚糖4，和磷脂酰肌醇蛋白聚糖5)是磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族的成员。该家族的成员有大小均一(约60kDa)的核心蛋白，共有特异、高度保守的半胱氨酸序列，并通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定结合到细胞膜上。

Motomura等人发现GPC3在小鼠体内可诱导出GPC3特异性的抗肿瘤免疫，但GPC3不会在小鼠体内导致自身免疫疾病的发生。同时发现，具有GPC3特异性的杀伤性T细胞(CTL)可以向表达GPC3的肿瘤组织发生定向迁移，而不引起自身免疫性的破坏。因此，GPC3诱导的特异性CTL定向移动发挥抗肿瘤免疫作用可以作为治疗HCC及黑色瘤的一种可能手段。并通过实验证实CTL表位可在小鼠体内被CTL所识别并诱导特异性的细胞免疫，该发现对以GPC3为靶点的肿瘤免疫治疗有重要的意义。

HBsAg疫苗与传统的疫苗相比具有如下优点：1.无需免疫佐剂，即能诱导出高效而特异的细胞免疫和体液免疫；2.HBsAg本身不能复制，也无感染性；3.HBsAg在体外能被大量扩增，并易于浓缩和纯化。上述特点表明，HBsAg具有减毒活病毒疫苗的免疫原性，但无其缺点。以特异性的外源抗原(基因)插入HBsAg或以外源CTL表位替代HBsAg上特异性的内源CTL表位能否在体内诱导出高效而特异的细胞免疫，越来越成为疫苗研究的热点。现已证明，在保留其有效的包装蛋白表位基础上，在HBsAg基因开放性阅读框架(open reading frame，ORF)上定位突变掉内源性CTL表位并建立核酸内切酶酶切位点，构建好的重组质粒允许插入一个或多个外源表位，在保留HBsAg部分生物学和免疫学特性的基础上，还能保证外源性表位具有免疫活性。

非专利文献王文敬等，GPC-3 CTL表位表达载体构建，南方医科大学学报，2009，29(8)，1548-1550；公开了一种构建编码GPC3-HBsAg重组蛋白表达载体，其采用GPC3的CTL表位分别替换HBsAg中的FLG、LLD和SIL表位而获得表达载体，并具有一定免疫原性。但是，本领域中HBsAg存在多个CTL表位，替换的表位不同，免疫原性相差较大，因此选择合适的HBsAg的CTL表位用于替换，对获得的重组蛋白的免疫原性具有决定性的影响。

发明内容

本发明的第一方面是提供一种GPC3-HBsAg重组蛋白，其以重组的乙肝表面抗原(HBsAg)为分子骨架，利用外源CTL表位替换HBsAg内源性CTL表位；所述其他外源CTL表位为GPC3的CTL表位。

在本发明的一个优选实施方案中，在所述重组的乙肝表面抗原(HBsAg)中，一个、二个、三个或更多个HBsAg内源性CTL表位被一个、二个、三个或更多个GPC3的CTL表位所替换。

在本发明的另一个实施方案中，所述重组的乙肝表面抗原(HBsAg)的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；在所述SEQ ID NO：1序列中，HBsAg内源性CTL表位相应地被GPC3 CTL表位所替换。

在本发明的另一个实施方案中，所述编码HBsAg内源性CTL表位选自下表中的一个、二个、三个或更多个表位，具体如表1所示：

表1 HBsAg蛋白中内源性CTL表位