[发明专利]低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法在审
| 申请号： | 201510489709.7 | 申请日： | 2015-08-11 |
| 公开（公告）号： | CN105154471A | 公开（公告）日： | 2015-12-16 |
| 发明（设计）人： | 张健民;高毅 | 申请（专利权）人： | 南方医科大学珠江医院 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85;C12N5/10;A01K67/027 |
| 代理公司： | 北京市立方律师事务所 11330 | 代理人： | 刘延喜;王增鑫 |
| 地址： | 510282 广东*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 表达 perv 肝细胞 制备 方法 | ||
1.一种低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(1)分别制备含有应用于RNA干扰技术的siRNA的重组载体、应用于CRIPRS/Cas9技术的gRNA的重组载体和含有应用于所述CRIPRS/Cas9技术的Cas9的载体；
(2)将所述三种载体共同转染至猪体细胞，培养所述经转染的猪体细胞，筛选并鉴定以获得单克隆转基因猪体细胞；
(3)利用体细胞核移植技术获得含有所述转基因猪体细胞的核基因的转基因猪；
(4)提取所述转基因猪的肝细胞。
2.如权利要求1所述的低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法，其特征在于：所述含有siRNA的重组载体、含有gRNA的重组载体和含有Cas9的载体以1：1：1的比例混合以进行共同转染。
3.如权利要求1所述的低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法，其特征在于：所述siRNA根据PERV基因的编码区pol和gag片段进行设计。
4.如权利要求3所述的低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法，其特征在于：用于将所述siRNA转染到目标细胞的载体为Psilencer3.1-H1-Neo。
5.如权利要求1所述的低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法，其特征在于：所述gRNA的序列为SEQNo.1所示。
6.如权利要求5所述的低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法，其特征在于：所述gRNA的PCR引物的序列为SEQNo.2和SEQNo.3所示。
7.如权利要求5所述的低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法，其特征在于：用于将所述gRNA转染到目标细胞的载体为U6-gRNA。
8.如权利要求1所述的低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法，其特征在于：所述含有Cas9的载体为pCMV-hCAS9。
9.如权利要求1所述的低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法，其特征在于：所述猪体细胞为猪胚胎成纤维细胞。
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