[发明专利]基于IgY的检测母牛早孕的胶体金试纸条的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域中的检测诊断试剂盒的制备和应用，具体涉及一种基于IgY的检测诊断母牛早孕的胶体金试纸条的制备方法。

背景技术

孕酮(Progesterone'简称P4)是一种甾体类激素,主要由黄体及胎盘产生。母畜体内的孕酮(P4)主要在卵巢合成，是反映卵巢活动的精确指示剂(MahaAl-AsmakhMSc,2007)，在控制母畜生殖活动的过程中发挥重要功能。

母畜在妊娠期间体内P4水平会远远高于基础水平，且会一直持续到分娩(Fatimaetal.,1999；史远刚等,1996)。通过测定母畜体液(如尿液、血液、乳汁等)中的P4水平及其含量变化，不但能够了解母畜动物的生殖生理规律，而且还能够监测母畜生殖系统疾病；同时，这也是研究母畜生殖生理及生殖系统疾病的重要途经，是预防和治疗母畜繁殖障碍性疾病的一种有效方法。测定母畜血液或者奶中的孕酮含量，还可以用于早孕诊断、发情鉴定及不孕症诊断(刘显义等,1984)；亦可用于母畜卵巢机能、繁殖疾病和产科疾病的研究；同样还可用于检测人工授精效果、激素试验，并为遗传分析提供了有效的生理指标等。早期妊娠诊断对于改善乳牛繁殖情况、减少空怀时间、缩短胎间距、提高乳牛饲养的经济效益具有重要意义。

卵黄抗体(eggyolkantibody，IgY)是通过对禽类(鸡)免疫注射特定抗原，从而在体内产生IgY，经血液由母体传递到卵黄内，在卵黄中富集，进而通过分离卵黄，获得的特异性多克隆抗体。相对于从哺乳动物血清中获得抗体，避免了常规的动物采血，减轻了动物的痛苦，同时通过卵黄获得抗体，产量大，制备简单，每枚蛋中可以提纯50～100mg的抗体，且母鸡易于饲养，费用低，便于大规模的生产特异性抗体，经济优势明显。与哺乳动物免疫球蛋白G(immunoglobulinG，IgG)相似，IgY的Fab片段包含抗原结合位点，Fc片段包含的位点有补体激活功能、调理素作用和致敏过敏反应作用等功能。但是其结构同哺乳动物有些不同，相对于IgG，IgY重链的氨基酸残基数量多于IgG，且重链恒定区(CH区)数量多于IgG，而轻链小于IgG。IgY理化特性及抗酶解特性等不同于IgG，使IgY相对于IgG更适合用于治疗制剂。IgY等电点(PI)在5.7-7.6之间，在pH4.0～11.0时IgY稳定，比兔IgG对酸变性更为敏感，当pH值从4降到3时，IgY活性迅速丧失，而IgG对此只受到微小影响；IgY在低温下储存时性能较稳定，室温下可保持6个月的活性，4℃储存6～7年活性下降仅5％(JaradatZW,MarquardtRR.2000.StudiesonthestabilityofchickenIgYindifferentsugars,complexcarbohydratesandfoodmaterials.FoodandAgriculturalImmunology,12(4):263-272)(卵黄抗体IgY，在不同的糖，复合碳水化合物和食品原料的的稳定性研究。粮食和农业免疫学杂志)；IgY抗胃蛋白酶消化的稳定性较牛IgG差，但抗胰蛋白酶和糜蛋白酶能力则较强(ShimizuM,NagashimaH,SanoK,etal.1992.MolecularstabilityofchickenandrabbitimmunoglobulinG.BiosciBiotechnolBiochem,56(2):270-274)(鸡和兔免疫球蛋白IgG的分子稳定)。由于系统发生学距离造成哺乳动物和鸡抗体特异性的差异，相对于哺乳动物IgG，IgY应用于检测也具有多方面的优势如：IgY与风湿因子、人类抗鼠抗体(HAMA)没有交叉反应，无补体系统活性和异质性凝集素，且不结合蛋白A和蛋白G，可以避免交叉反应。此外，禽类针对保守性强的蛋白质往往能引发较哺乳动物抗体更强烈的抗体反应，成为有关抗体研发的重要选择因素。