[发明专利]重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法

说明书

本发明涉及利用重组DNA技术生产基因工程药物，属于生物技术领域，具体涉及一种重组人血管内皮生长因子受体‑抗体融合蛋白的纯化方法，即将含有重组人血管内皮生长因子受体‑抗体融合蛋白的细胞上清依次经过亲和层析、阴离子交换层析、阳离子交换层析、疏水层析、脱盐层析得到高质量的重组人血管内皮生长因子受体‑抗体融合蛋白。本发明具有成本低、目的蛋白纯度高、工艺过程便于控制和易于规模化放大生产等特点。

技术领域

本发明涉及利用重组DNA技术生产基因工程药物，具体涉及一种重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法，属于生物技术领域。

背景技术

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)通过与特异性受体-血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)结合刺激新生血管的形成。在肿瘤生长过程中，VEGFs数量激增，与血管生成抑制因子之间的调节失衡，极大地促进了内皮细胞的分裂增殖和迁移，提高血管通透性，为肿瘤的生长和转移提供良好的微环境。

重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白(VEGF-Trap)是重组融合蛋白，包含人VEGFR特异性结构域VEGFR-1的第二结构域、VEGFR-2的第三结构域以及IgG1的Fc部分。VEGF-Trap是特异性拮抗剂结合并抑制血液中及血管外的游离的VEGF及P1GF。VEGF-Trap可用于治疗老年黄斑变性(AMD)等眼内血管疾病及肿瘤。目前国外已上市重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白为Aflibercept，商品名分别为EYLEA及ZALTRAP，分别用于治疗老年黄斑变性(AMD)及肿瘤。

重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白属于融合蛋白，结构较为复杂，其二硫键和糖基化位点较多，其中含有较多的碱性电荷异构体，给下游纯化工作带来很大困难。

发明内容

本发明提供一种适宜规模化扩大生产的、快速、高效的重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白(VEGF-Trap)的纯化方法，具有工艺简单、成本低，目的产物纯度高以及中间过程便于控制和易于规模化放大生产等特点。

本发明将含有重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白上清依次经过亲和层析、阴离子交换层析、阳离子交换层析、疏水作用层析、脱盐层析及除病毒纳滤得到高质量的重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白原液。

本发明的技术方案如下，具体步骤为：

亲和层析

(1)用含盐的平衡缓冲液对亲和层析柱进行平衡，将重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的细胞培养上清进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于亲和层析介质上，上样结束后继续用含盐的平衡缓冲液进行冲洗，再用不含盐的平衡缓冲液进行冲洗；

(2)用pH值3.0～4.5的平衡缓冲液对步骤(1)处理的亲和层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液，然后进行病毒灭活；

阴离子交换层析

(3)用含盐的平衡缓冲液对阴离子交换层析柱进行预平衡，再用不含盐的平衡缓冲液进行平衡，将步骤(2)中病毒灭活后的蛋白液进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于阴离子交换层析介质上，上样结束后继续用不含盐的平衡缓冲液进行冲洗，再用含0.02～0.06mol/L盐的平衡缓冲液进行冲洗；

(4)用含0.1～0.2mol/L盐的平衡缓冲液对步骤(3)处理的阴离子交换层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从阴离子交换层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液；

阳离子交换层析