[发明专利]一种高产木糖醇的热带假丝酵母基因工程菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种高产木糖醇的热带假丝酵母基因工程菌及其应用，属于食品甜味剂生物制造技术领域。

背景技术

木糖醇(Xylitol)，也称戊五醇，是一种五碳多羟基糖醇，化学分子式C₅H₁₂O₅，外形为结晶性粉末或白色晶体，极易溶于水，微甜与蔗糖相当，微溶于甲醇和乙醇，热稳定性好。木糖醇不需要胰岛素的参与就可以在人体中代谢，不会造成人体血糖的急剧变化，因此可以作为糖尿病人专用食品的甜味剂，并已经广泛应用于口香糖、胶姆糖、太妃糖、软糖、巧克力、果冻、冷饮、口含片、漱口剂、润喉药物、止咳糖浆等食品、日化及医药工业；木糖醇还在卷烟、蓄电池、表面活性剂等方面有许多重要的应用。木糖醇的安全性高，是动物正常代谢的中间产物，人体每天代谢产生5-15g木糖醇。在自然界中，木糖醇也广泛存在于多种果蔬，但含量很少，通常少于900mg/100g。

目前木糖醇生产主要采用化学合成法：将农业植物纤维废料(如玉米芯、棉籽壳、蔗糖渣)水解得到木糖，在高温高压条件下，镍催化剂催化加氢使木糖还原成木糖醇。该方法要求木糖纯度高(95％以上)，生产成本高，设备要求高，副产物成分复杂，环境污染较大。

热带假丝酵母菌可转化木糖生成木糖醇，该生化过程的原料木糖无需纯化设备，反应条件温和，无需耐高压设备，这种绿色、清洁生产技术成为近年研究开发的热点。目前利用热带假丝酵母生产木糖醇最大的缺点是转化率不高，一般以木糖为原料用微生物转化法的木糖醇转化率为65％-85％。国内已有在其内通过增加辅酶基因的拷贝数的方法从而增加木糖醇产量的方法，但效果并不是很理想。

发明内容

本发明提供了首先一株高产木糖醇的热带假丝酵母工程菌，是敲除了热带假丝酵母基因组上的木糖醇脱氢酶的编码基因XYL2，得到XYL2两条等位基因均缺失的热带假丝酵母工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述木糖醇脱氢酶的编码基因XYL2的核苷酸序列如GenBankDQ201637.1所示。

本发明还提供一种构建所述热带假丝酵母工程菌的方法，是以热带假丝酵母的URA3基因作为选择标记，通过同源重组的方式实现XYL2基因的敲除，并且通过5-氟乳清酸(5-FOA)实现URA3基因的弹出和重复利用。

本发明还提供了一种利用上述热带假丝酵母工程菌生产木糖醇的方法，是以含有木糖的发酵培养基，接种所述热带假丝酵母工程菌，进行发酵。

在本发明的一种实施方式中，是以木糖、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨为组分配制发酵培养基，接种所述热带假丝酵母工程菌，进行好氧发酵。

在本发明的一种实施方式中，是以秸秆原料进行酸水解或酶水解，所得木质纤维素水解液作为发酵培养基，接种所述热带假丝酵母工程菌，进行好氧发酵。

在本发明的一种实施方式中，是以木糖母液为基质配制发酵培养基，接种所述热带假丝酵母工程菌，进行好氧发酵。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基是含有木糖母液200g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，KH₂PO₄5g/L的培养基；所述木糖母液含有木糖2g/L、葡萄糖0.4g/L。

本发明通过删除木糖醇脱氢酶基因，从根本上阻止木糖醇脱氢酶基因的表达，阻断木糖醇的代谢途径，从而达到木糖醇的累积，显著提升了木糖醇的转化率。本发明所提供的热带假丝酵母工程菌，在以含有木糖、葡萄糖或甘油或阿拉伯糖等混合碳源的发酵培养基中能够将木糖高效转化为木糖醇，转化率达到95％以上。同时，热带假丝酵母工程菌能够利用其余种类碳源生长，细胞生长速度较快。该发明为微生物发酵法生产木糖醇提供了一种有益的方法。

附图说明

图1为木糖醇脱氢酶基因PCR产物和重组质粒pMD19T-XYL2酶切产物电泳图

图2重组质粒pMD19T-XYL2反向PCR产物电泳图

具体实施方式

实施例1构建热带假丝酵母基因工程菌