[发明专利]一种利用ITS序列鉴定库拉索芦荟品种的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种鉴定芦荟品种的方法，特别涉及一种利用ITS序列鉴定库拉索 芦荟品种的方法，属于植物种质资源的鉴定技术领域。

背景技术

芦荟(Aloe)是一种长绿多肉质草本植物，隶属于多年生单子叶植物纲 (Monoctyledoneae)天门冬目(Asparagales)独尾草科(Asphodelaceae)。该科以 前的分类法中大部分属分在百合科(Liliaceae)内，被列为亚科。芦荟属(AloeL.) 为1754年瑞典分类学大师林奈的建立的，发表在他的经典著作《植物属志》第五 版。1980年出版的《中国植物志》14卷(百合科)，将芦荟属隶属于广义的百合科中。 百合科有230个属，3500个种，本属内有300余种。

芦荟的用途很广，它的有效成分对人体有特殊保健功能和抗肿瘤的作用，目前 已广泛应用于保健品、化妆品、食品、观赏和药物工业上。芦荟属(AloeL.)植物种 类繁多，变异多样，种质资源异常丰富，传统的芦荟种分类主要依据是形态学、细 胞学。根据形态学进行分类比较直观。但由于芦荟和近缘属间杂交可育，不断出现 一些新的属间杂交种；且芦荟属内同名异种和异名同种现象多有发生，造成不同种 或亚种间的亲缘关系比较混乱，形态学有时难以反映种间的遗传差异和亲缘关系。 而有关其种间亲缘关系的研究资料甚少。目前在我国确认能用于食品的只有库拉索 芦荟这一品种，因此从分子水平对芦荟种分类、鉴定和确定亲缘关系的研究具有十 分重要的意义。

DNA条形码是利用标准的基因片段对物种进行快速鉴定的技术，已经成功用 于生物物种分类和鉴定、生态学调查和生物多样性评估等研究领域，为植物遗传多 样性检测提供了更直接、更精确的方法，即直接检测DNA本身的序列变化。由于 避免了根据表型性来推断基因型时可能产生的各种问题，DNA分析方法成为了目前 为止最有效的遗传学分析方法，ITS序列是中度重复序列，广泛分布于基因组并且 是同步进化，它的碱基序列同源性的程度决定生物之间的亲缘关系远近。同时它存 在于细胞核中，避免了其他DNA条形码基因存在于叶绿体中，而在芦荟凝胶中含 量极低的问题。因此本发明专利将DNA条形码技术应用于鉴别芦荟品种，通过扩 增ITS序列和对其进行分析，从分子水平探讨它们之间的亲缘关系，建立了在分子 水平检测食品中芦荟真伪及是否为库拉索芦荟的方法。

发明内容

本发明的主要目的是针对目前存在的芦荟原料真伪及品种问题，提供一种鉴别 芦荟材料真伪及其是否为库拉索芦荟的核苷酸序列及方法，从DNA水平上分析芦 荟种植资源的遗传特征，为鉴定库拉索芦荟提供有效的分子标记。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种利用ITS序列鉴定库拉索芦荟品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)收集健康新鲜芦荟样品的成熟叶片，提取总DNA；或者从芦荟食品中提 取芦荟凝胶总DNA；

(2)以步骤(1)中提取的DNA为模板，使用SEQIDNO:2和3所示引物进 行PCR扩增反应，扩增ITS序列；

(3)PCR产物进行直接测序；

(4)利用MEGA4.1软件对测序结果进行序列比对和聚类分析，绘制系统发育 树，根据序列比对和聚类分析结果鉴定库拉索芦荟品种。

其中，所述的ITS序列来源于库拉索芦荟的rDNAITS序列，是位于18S和 26SrRNA之间的DNA序列，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。

在本发明中，优选的，收集健康新鲜芦荟样品的成熟叶片，进行切割处理后置 于柔软且透气性较好的纸袋，并放在装有硅胶的干燥盒中进行干燥；或者收集健康 新鲜芦荟样品的成熟叶片，进行切割处理后放入一次性培养皿中，用保鲜膜封好， -20℃冷冻至芦荟叶片冷冻完全，随后放入冻干机中冷冻干燥24h，后放在装有硅胶 的干燥盒中进行干燥。

在本发明中，优选的，所述的硅胶是粉末状的直径为20～30A的白色硅胶与蓝 色变色硅胶的混合物。

在本发明中，优选的，所述的PCR扩增反应的反应体以25μL计为：

在本发明中，优选的，其特征在于，所述的PCR扩增反应的反应条件为：94℃ 预变性4min，94℃变性40s，52℃复性40s，72℃延伸2min，30个循环，最后72℃ 延伸10min，4℃保存。