[发明专利]猪繁殖与呼吸综合征病毒纳米PCR鉴别诊断试剂盒及其检验方法

说明书

技术领域

本发明涉及猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测技术领域。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS)又称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)引起的一种以猪繁殖障碍和呼吸道系统疾病为主要症状的传染病。目前，我国猪群主要流行经典猪繁殖与呼吸综合征病毒（Classicalporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,C-PRRSV）与高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（Highlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,HP-PRRSV），两种毒株基因组的主要区别是HP-PRRSVNSP2基因存在30个不连续氨基酸的缺失，而C-PRRSV没有缺失。

PRRSV的鉴别诊断方法主要包括传统的病毒分离、血清学实验、聚合酶链式反应（PCR）等，这些方法在病毒检测中发挥了重要作用。其中PCR检测方法由于操作简单，灵敏性高、重复性好等优点被广泛应用。但在实际应用中，PCR技术存在诸多局限性，例如对复杂体系的扩增会出现非特异性产物扩增以及扩增效率不够高等问题。为解决以上问题，寻找可以提高PCR特异性和效率的添加剂显得极其重要。

纳米PCR技术是一种新型的PCR技术，其原理是把粒径为1nm～100nm的固相纳米金属颗粒悬浮在液体中形成纳米流体。由于纳米材料具有良好的热传导性，因此在添加了纳米金颗粒的PCR循环体系中，PCR反应会更快地达到目标温度，减少了在非目标温度的停留时间，进而缩短整个体系达到温度平衡所用的时间，减少非特性扩增，提高特异性扩增产量。因此，目前亟需建立一种能够快速、特异的鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒的纳米PCR诊断手段。

发明内容

本发明针对上述现有技术的不足，提供了一种用于猪繁殖与呼吸综合征病毒检测的纳米PCR鉴别诊断试剂盒及其应用，该试剂盒能够快速、特异的区分猪繁殖与呼吸综合征病毒。

本发明所采取的技术方案是：一种用于猪繁殖与呼吸综合征病毒检测的纳米鉴别诊断PCR试剂盒，包括5×反转录缓冲液、dNTPMixture、反转录酶、RNA酶抑制剂和反转录引物，其特征在于所述试剂盒还包括2×NanoPCRMix、上游引物和下游引物；所述上游引物的序列为SEQIDNo.1所示，所述下游引物的序列为SEQIDNo.2所示。

引物是根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒序列，在其NSP2基因保守序列区域设计的一对特异性引物。

优选的，2×NanoPCRMix由DNA聚合酶、2×NanoPCRbuffer和dNTPMixture组成。

优选的，反转录酶为M-MLV反转录酶。

优选的，反转录引物的序列为SEQIDNo.2所示。

优选的，所述试剂盒还包括RNA提取试剂：TRIzolLSReagent、氯仿、异丙醇、75%乙醇。

优选的，所述试剂盒还包括阳性对照。

其中，阳性对照可为将猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株与高致病性毒株分别接种Marc-145细胞后，收集72～96小时细胞培养物，测定TCID₅₀，通过甲醛灭活后，两种毒株混合，最终含量均为10⁵TCID₅₀/mL。

本发明还提出了所述的试剂盒在制备检测待测样品中是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒的产品中的应用。

应用所述试剂盒检测待测样品中是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，包括如下步骤：

1、病毒RNA的提取

（1）将250μL经过预处理的待测样品加入750μLTRIzolLSReagent中，剧烈振荡2min，室温放置5min。加入250μL氯仿，剧烈振荡1min，室温放置5min后，4℃12,000rpm离心15min，将上层水相转入新的离心管。（2）加入与水相等体积的异丙醇，混匀，室温静置15min，4℃12,000rpm离心15min，轻轻倒去上清，然后加入DEPC处理的75%乙醇700～800μL，4℃12,000rpm离心5min，弃上清。（3）将沉淀自然风干或于50℃干燥箱中晾干，用适量无核酸酶水充分溶解后立即进行PCR或贮存于-80℃备用。