[发明专利]小反刍兽疫病毒CH/GDDG/2014株全基因组序列及其扩增引物对

说明书

本发明公开了小反刍兽疫病毒CH/GDDG/2014株全基因组序列及其扩增引物对。本发明将病毒基因组序列分为11个片段，用一步法RT‑PCR方法扩增相应的cDNA，将扩增的PCR片段克隆到pGM‑T载体上进行核酸测序。本发明可以有效地扩增出目的片段，提供了全基因组序列，有利于研究小反刍兽疫病毒的遗传学、分子流行病学及反向遗传学研究等。

技术领域

本发明专利属于分子生物学领域，涉及小反刍兽疫基因型4型全基因组序列测定方法，具体的涉及小反刍兽疫病毒CH/GDDG/2014株全基因组序列测定方法。

背景技术

小反刍兽疫是严重危害山羊、绵羊、野生反刍动物等动物健康的烈性传染病，可引起感染动物的肺炎、腹泻、口炎、流产等多种临床症状，世界动物卫生组织将其列为A类动物疫病。小反刍兽疫有4个基因型，不同基因型或同一基因型毒株的基因组间存在较大的差异。2007年和2013年，在我国的西藏和新疆暴发了两波小反刍兽疫疫情，尤其是第二波疫情，波及20多个省市自治区，给我国养羊业及野生反刍动物带来了巨大的经济损失。研究表明新型基因4型小反刍兽疫病毒是罪魁祸首。尽管我国养殖场已经开始使用小反刍兽疫疫苗(基因2型)，但仍有野生型病毒暴发流行。目前，虽有新型基因4型小反刍兽疫病毒的全基因组序列报道，但是没有公开显示其如何扩增获得，这不利于我国构建新型小反刍兽疫的反向遗传系统，同时，进一步会影响我们了解该病毒的生长曲线、病毒滴度以及致病性等生物学特征。

基于以上问题，公开一种有效、简单、准确的新型基因4型小反刍兽疫病毒的全基因组序列测定方法很有必要。

发明内容

本专利的目的在于运用分子生物学、生物信息学等方法进行引物设计、序列比对及反应体系优化，提供新型基因4型小反刍兽疫病毒CH/GDDG/2014株的全基因组序列及其扩增引物对。

本发明提供的小反刍兽疫病毒CH/GDDG/2014株全基因组序列，其序列如SEQ IDNo.1所示。

本发明还提供用于扩增小反刍兽疫病毒CH/GDDG/2014株全基因组序列的引物，包括如SEQ ID No.2～23所示的引物。

本发明还提供一种扩增小反刍兽疫病毒CH/GDDG/2014株全基因组的方法，包括以下步骤：

(1)提取小反刍兽疫病毒CH/GDDG/2014株的RNA；

(2)用SEQ ID No.2～23所示的引物对小反刍兽疫病毒全基因组序列进行分段一步法RT-PCR扩增；

(3)目的片段的回收、连接、转化、阳性菌的鉴定及测序；

(4)利用DNAStar等生物信息学软件对所测定的序列进行比对分析、序列拼接，将11个片段首尾相连，得到小反刍兽疫病毒CH/GDDG/2014株全基因组序列。

其中，所述的50μL一步法RT-PCR反应体系包括：2×Buffer 25μL，每段扩增上下游引物各1μL，Mix 1μL，病毒RNA 5μL，灭菌ddH₂O 17mL；

其中，所述的一步法RT-PCR反应程序包括：50℃反转录30min，95℃预变性5min，35个循环(95℃变性30s，53℃～60℃退火30s，72℃延伸50s～188s)，72℃再延伸10min。

本发明将病毒基因组序列分为11个片段，用一步法RT-PCR方法扩增相应的cDNA，将扩增的PCR片段克隆到pGM-T载体上进行核酸测序。本发明可以有效地扩增出目的片段，提供了全基因组序列，有利于研究小反刍兽疫病毒的遗传学、分子流行病学及反向遗传学研究等。