[发明专利]一种山羊骨骼肌特异性基因actin启动子驱动的Fat-1表达载体及其构建方法

权利要求书

1.一种山羊骨骼肌特异性基因actin启动子驱动的Fat-1表达载体，其特征在于该表达载体是首先将Fat-1基因克隆入pEGFP-N1载体，构建成pEGFPN1-Fat-1载体，然后将PCR扩增得到的CMV增强子插入无启动子和增强子的pEGFPN1-Fat-1载体，构建成pEGFPN1-Fat-1-Ehancer载体，最后将骨骼肌特异性基因α-actin启动子插入pEGFPN1-Fat-1-Ehancer载体中，构建成的α-actinpromoter-pEGFPN1-Fat-1表达载体。

2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于该表达载体的具体构建过程为：

(1)利用平末端连接构建pEGFPN1-Fat-1载体：

将PCAGGS-Fat-1质粒经EcoRI酶切后回收Fat-1基因，将pEGFP-N1质粒经BamHI酶切后回收线性化的pEGFP-N1质粒载体，将回收后的Fat-1基因和线性化的pEGFP-N1质粒载体的cDNA末端补平，进行平末端连接构建成pEGFPN1-Fat-1载体；

(2)构建pEGFPN1-Fat-1-Ehancer载体：

根据PCAGGS载体的CMV-Enhancer序列，设计一对含有特异性酶切位点的引物，通过PCR方法扩增CMV-Enhancer基因，然后与19-TVector连接得到19-T-CMV-enhancer载体，利用SalI和AseI双酶切19-T-CMV-enhancer载体并回收酶切产物CMV-Enhancer基因片段，将酶切产物定向克隆到无启动子和增强子的pEGFPN1-Fat-1载体质粒中，构建成pEGFPN1-Fat-1-Ehancer载体；

所述的含有特异性酶切位点的引物为：

Enhancer-F：GCATTAATGGGGTCATTAGTTCATAGCCC

Enhancer-R：GCGTCGACTGGTAATAGCGATGACTAATACG

(3)构建α-actinpromoter-pEGFPN1-Fat-1表达载体：

采用分段PCR扩增的方法，分别从羊肌肉组织DNA中扩增1824bp和1347bp两片段Part1和Part2，同时首尾相连插入pEGFPN1-Fat-1-Ehancer质粒同一位置构建成α-actinpromoter-pEGFPN1-Fat-1表达载体；各片段引物为：

part1F:TCATCGCTATTACCAGTCGACAGCCCCCCTCACTATTCTTTT

part1R:CTGGGCAGCAGTTTTCCT

part2F:GAAAACTGCTGCCCAGCCTACAGTGCAACGTCCTTGTCTT

part2R:CGGGCCCGCGGTACCGTCGACAGGCTTCTCTCGGCGCTGTCCGCT。

3.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于步骤(3)中扩增Part2时，添加DMSO进行扩增优化。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于扩增Part2时，20μL体系中添加0.6～0.8μLDMSO进行扩增。